高效液相在中药鉴定中的应用课件版张林小改

第五章高效液相色谱法在中药鉴定中的应用

第一节概述一、定义

高效液相色谱法（HighPerformanceLiquid

Chromatograph,HPLC）是20世纪60年代末70年代初在经典液相柱色谱的基础上发展起来的一项新型分离分析技术，系指采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。因需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（HighPressureLiquidChromatograph）,又因分析速度快而称高速液相色谱法（HighSpeed

Liquid

Chromatograph）。

与经典液相色谱法的区别:填料颗粒细小而均匀，柱效高，但阻力大，故需用高压输送流动相。二、高效液相色色谱法的分离原理（过程）

是借不同组分在两相间亲和力、吸附力、离子交换过程或分子排阻作用等差异，使溶质在固定相和流动相之间进行一种连续多次的分配（过程）而进行分离。优势：可分离极性的、离子化的、不挥发的、相对分子量大的和热不稳定的化合物，具有用量少、分离效能高、检测灵敏高、分析速度快、专属性强、应用范围广的特点。广泛应用于各种中药的鉴别中，在中药鉴定方面具有较好的应用前景。

《中国药典》2005版中，用HPLC法检测的药材、饮片为164种，中药制剂308种，其品种数是2000年版的4倍多，2010版药典也大量采用高效液相色谱方法建立药品的鉴别、检查和含量鉴定，该方法已成为药典中应用最为广泛的含量测试技术。三、HPLC分离模式与主要分离机制分离模式主要保留机制液-固吸附吸附剂的表面吸附键合相溶质在两相间的分配或溶质与极性固定相的吸附离子交换溶质离子与填料上的反电荷层之间的相互作用离子对电中性离子对在两相中的分配分子排阻基于流体动力学体积的过滤作用手性溶质手性异构体与填料手性作用点间非对应异构体相互作用。亲和溶质与固定化配体间生化专属结合其中，键合相色谱法是由液－液色谱法即分配色谱发展起来的。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。

正相高效液相色谱法－色谱柱固定相极性大于流动相极性。反相高效液相色谱法－色谱柱固定相极性小于流动相极性。分配色谱正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法反相色谱法固定相极性高～中

中～低流动相极性低～中中～高组分洗脱次序极性小先洗出

极性大先洗出反相高效液相色谱柱材料固定相：通用十八烷基硅烷键合硅胶（ODS），简称ODS柱或C18柱。流动相：常用水作主体，加一定比例的甲醇、

乙腈、异丙醇、丙酮或四氢呋喃作改性剂，或以缓冲溶液作为流动相。

第二节高效液相色谱仪

主要部件：贮液瓶、高压输液泵（含流动相脱气装置）、进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统。图1

高效液相色谱仪示意图1-流动相贮瓶；2-输液泵；3-进样器；4-色谱柱；5-检测器；6-废液出口或馏分收集器；7-记录装置；8-过滤器图2

高效液相色谱仪流程1-贮液罐；2-脱气装置；3-梯度洗脱装置；4-高压输液泵5-流动相流量显示；6-柱前压力表；7-输液泵泵头；8-过滤器；9-阻尼器；10-进样装置；11-色谱柱；12-检测器；13-数据处理系统；14-废液贮罐

一、输液泵(梯度泵)为HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。目前多采用梯度系统，又称梯度泵泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。梯度泵的作用梯度：在操作过程中改变洗脱溶剂的组成，依分离需要可改变pH值、离子强度或溶剂强度。改变溶剂组成，使同一种流动相在不同比例下同时兼顾不同性质的组分。常用于待分析样品中含多种不同类型组分的情况。

二、进样器六通阀进样（常用）优点：进样量准确、重复性好（微量进样器的针为平头，高档仪器带有自动进样器）。三、色谱柱—HPLC系统的心脏作用：分离系统的核心部分分类：正相色谱柱和反相色谱柱常用色谱柱：中药所含成分多为脂溶性，分析多选用反相色谱柱。反相高效液相色谱柱材料固定相：通用十八烷基硅烷键合硅胶（ODS），简称ODS柱或C18柱。流动相：一般选用水，再加入一定比例的甲醇或乙腈作改性剂。

四、检测器—HPLC的三大关键部件之一HPLC检测器的要求：灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。常用检测器：紫外（UV）、蒸发光散射（ELSD）、示差折光（RID

）

、荧光（FD）、电化学红外、

质谱等检测器。1、紫外检测器(UltravioletDetector)适用范围：最广。多数有紫外吸收的芳香族化合物（黄酮类、酚酸类、蒽醌类、部分生物碱类等）。限制：1.没有紫外吸收的物质不能检测；2.尽量选择在检测波长下没有背景吸收的流动相。紫外检测器分类：单波长紫外检测器。可变波长型检测器。二极管阵列检测器等。2．通用型检测器适用范围（化合物）无紫外吸收的化合物（多糖、单糖及部分蛋白）紫外吸收较弱（ε＜100）的化合物（黄芪甲苷等），流动相在短波长处有干扰。被测成分浓度较低，信噪比太低而无法使用紫外检测器。（1）示差折光检测器（RID

）

优点：最先使用且用途最广。所有化合物均具有折射率，理论上可适用于中药中所有成分。

缺点（局限性）：不可用RID进行梯度洗脱，因流动相成分（含溶液和添加剂）具明显折光效应。温度、流动相中溶入气体等因素均会产生折光效应而限制RID的应用。

（2）蒸发光散射检测器（ELSD）适用条件：某些无紫外吸收、又不适用RID示差检测的中药成分，主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、维生素及甾体类等化合物。

ELSD检测器的检测原理：组分随流动相进入雾化器而被雾化为小雾粒，雾粒进入可控蒸发器，使流动相气化蒸发而剩下微小组分颗粒，组分颗粒穿过光束产生光散射，散射光经光电二极管接收后转换成电信号。若流动相恒定，散射光通量与流通池中组分的量成正比（定量分析）。蒸发光散射检测器（ELSD）优点：①灵敏度高（检测限10ng）；②对流动相温度不敏感；③溶剂无干扰，可进行梯度洗脱；④无需校正即可定量（质量型检测器），可同时测定各种组分。应用ELSD时应注意的问题：①检测组分应为非挥发性，而流动相应为易挥发

性溶剂。②以缓冲溶液作为流动相时其必须具挥发性且缓冲液浓度尽可能低。③常用缓冲液组成：醋酸、甲酸、三氟醋酸、硝酸铵和磷酸氢二铵等组成。3．其他类型的检测器（自学）荧光检测器、电化学检测器等

四、数据处理装置－记录色谱图1、保留时间（tR）：可作定性指标。2、峰高或峰面积：与样品组分的浓度成正比，可作定量指标。第三节高效液相实验方法与评价

一、反相高效液相色谱法的主要实验技术

主要实验技术1、溶剂及供试样品的纯化

2、色谱柱的保护

3、色谱柱的平衡

4、色谱柱的清洗与再生

1、溶剂及供试样品的纯化流动相及改性剂的选用流动相主体：通常以二次蒸馏水为基础溶剂，最好用超纯水，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等，最好用色谱级试剂。1、溶剂及供试样品的纯化流动相纯化：出厂前已用0.25μm微孔滤膜过滤（早期曾用0.45μm微孔滤膜及G4微孔玻璃漏斗过滤），使用前必须经0.45µm(或0.22µm)微孔滤膜滤过。

供试样品纯化：以0.45μm微孔滤膜过滤。目的：防止微粒杂质堵塞流路或柱入口垫片。2、色谱柱的保护使用不当所致的不良现象：①理论塔板数下降、②色谱峰型变坏、③柱压力降

增大等，缩短色谱柱寿命。延长色谱柱寿命的措施：柱前连接内径2～3mm、长度不超过3cm的小型保护柱，填料与主柱相同。3、色谱柱的平衡在贮存运输过程中，反相色谱柱的保护溶剂（乙腈－水）因挥发使固定相填料的空间结构发生变化而影响分离效果。故新柱须平衡方可使用。

色谱柱的平衡方法①以纯乙腈或甲醇作流动相低速（0.2mL/min）将

色谱柱平衡过夜（此期间需断开检测器）。②逐渐增加流速至0.8mL/min冲洗30min，直到获

得稳定的基线，使填料充分平衡至最佳状态，确保柱的使用寿命并获良好结果和重现性。4、色谱柱的清洗与再生被测样本保留在柱中的杂质组分：无机盐、脂肪、

蛋白质等。杂质在柱内积聚将会影响柱效。杂质影响柱效的表现：宽峰、基线扰动、基线漂

移、柱压不稳等。常规（普通）洗脱：以20倍柱体积的甲醇、乙腈四氢呋喃等强洗脱溶剂洗脱。强化洗脱步骤：100％甲醇→100％乙腈→

75％乙腈－25％异丙醇→100％异丙醇→

100％二氯甲烷。以上强化步骤每种洗脱剂至少需10倍柱体积的

量，流速1～2mL/min。清洗后返回原始流动相，亦可按相反方向冲洗。清洗注意事项：以二氯甲烷清洗后必须用异丙醇再次清洗才可使用含水流动相，否则不能混溶。异丙醇粘度高，流速不宜过高，以免超压。若流动相含无机盐缓冲液，可能会析出结晶堵塞管路而造成柱压升高、峰分裂、拖尾等现象。流动相含无机盐缓冲液的清洗措施：

以高含水溶剂按极性梯度清洗（C18柱不可用纯水冲洗，否则影响其链状分子结构，应在水中加入5

％～10％甲醇或乙腈冲洗）。二、系统适用性试验1、容量因子：计算公式：tR为保留时间；tM为死时间。组分恒定的流动相洗脱：时，分离效果最佳，原则上k/≤20，否则需考虑更换洗脱系统。2.分离度R：（可从软件中读得数据）定量分析：R＞1.5结构相似的两种物质：R＜1.53.不对称（拖尾）因子：考察峰形是否对称的指标完全对称的峰形：一般要求：。4、理论塔板数n：一般要求：n＞3000（中药分析）n越高则表明柱效越好，分离效果好。三、方法学论证1、线性关系的考察：测定对照品不同进样量下所得出的峰面积，以进样量为x轴，峰面积为y轴，计算回归方程，一般要求r＞

0.995。

2、精密度考察：取同一份样品进样数次（5次或以上），每次进样量相同，计算几次所得峰面积的RSD，一般要求RSD<2％。

3、稳定性考察：取同一份样品，相隔若干时间进样（一般24小时内共测定6次或以上），每次进样量相同，要求几次所得峰面积的RSD≤2％。可认为该成分24小时内稳定。4、重复性考察：取同一份样品，按相同提取、纯化等方法，平行实验5次或以上，要求每次实验所测得峰面积的RSD≤

3％，方可用于定量分析。5、回收率考察：在已知含量的样品中加入已知量的对照品，按照相同的提取、纯化等方法，平行实验5次或以上，计算平均回收率，一般要求回收率应在95％～105％之间（衡量实验方法和操作对样品损失程度的大小）。

四、高效液相色谱法鉴别中药的注意事项（一）、根据中药所含成分的性质选择合适的分离

方法（正相或反相）。（二）、根据拟检测成分的特性，选择适宜的色谱柱流动相。（三）、检测成分的选择被测中药：单味药材或复方制剂。单味药材：选用该药材的主要有效成分、毒性成

分或影响疗效的化学成分作为鉴别指标。中药复方制剂：选择其中主药（君药）、辅药（臣药）作为主要对象，其次选毒剧药及贵重药材（四）、供试品溶液的制备方法1、中药样品前处理：选用适当提取方法，并对所提样品进行初步净化等。2、提取溶剂：选用对目标成分溶解度大而杂质成

分溶解小的溶剂。3、常用提取方法：冷浸法、连续回流法和超声波

提取法等。样品的净化：组成简单的样品：直接以HPLC鉴别。复杂成分的样品：需先净化。常用净化方法：液液萃取法。沉淀法。蒸馏法。色谱法等。预处理柱：进口：Merck厂的Extrelut（硅藻土）、美国BondElutColumn（硅胶，C8，C18，CCN，键合相等）、Waters公司的Sep-Pak柱。国产：PT一系列预处理柱等。以上预处理柱使用方便，操作简单，净化效率高。

（五）、其他注意事项：测定条件选择：溶剂的选择、流动相的选择、色谱柱的选择及检测器的选择等。1、流动相的一般要求：①纯度要高，一般使用色谱级的溶剂。②对样品要有适宜的溶解度。③溶剂的黏度要小。④与检测器相匹配。

流动相应不改变填料的任何性质。

2、样品溶剂要求（溶解试样的溶剂要求）：①对样品溶解度大。②对样品稳定。③与检测器相匹配。④

最好与流动相相同，即可允许大的进样量又不影响待测物的洗脱。⑤为提高分离效果及保持pH，有时可用缓冲溶液。常用缓冲溶液：醋酸盐和磷酸盐缓冲溶液。3、监测器的选用要求：样品有紫外吸收时选用紫外监测器，鉴别中药选用紫外检测器者占95％以上。检测样品所用波长的选择：检测样品所用吸收波长须大于溶剂的截止波长，常见溶剂的截止波长见表1。表1

常见溶剂的截止波长

溶剂截止波长／nm溶剂截止波长／nm水，环己烷，乙腈200三氯甲烷，乙酸245～250甲醇，乙醇，异丙醇，正丁醇，硫酸（96％），乙醚210四氯化碳，甲酸甲酯，乙酸乙酯260正己烷，对二氧六环220苯，甲苯，二甲苯290甘油，二氯甲烷235丙酮，丁酮，吡啶，二硫化碳335小结：用HPLC鉴别中药应根据其分析目的、样品性质和含量、现有设备条件等选择合适方法。五、DIONEX

P680型高效液相色谱仪操作流程

1．实验准备2.开机3.程序设置4.色谱图的实时观察和样品分析5.数据处理6.洗柱7.关机第三节高效液相色谱法在中药鉴别中的应用一、高效液相色谱法在定量测定中的应用高效液相色谱法在《中国药典》中对中药的鉴别主要是进行含量测定，以供试品与对照品的保留时间一致进行鉴别。（一）大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚等成分的含量测定（1）色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液（85:15）为流动相；检测波长为254nm。理论板数按大黄素峰计算应≥3000。

（2）对照品溶液的制备精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各80μg,大黄素甲醚40μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各2ml，混匀，即得（每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各16ug，含大黄素甲醚8μg）。

（3）供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液10ml，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时;放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取三次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

（4）测定法

分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含芦荟大黄素（C15H10O5）、大黄酸（C15H8O6）、大黄素（C15H10O5）、大黄酚（C15H10O4）和大黄素甲醚（C16H12O5）的总量不得少于1.5％。

（二）一清颗粒中黄芩苷的含量测定（1）色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调节pH值至2.7）（42:58）为流动相；检测波长为275nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。

（2）对照品溶液的制备精密称取黄芩苷对照品12.5mg，置250ml量瓶中，加甲醇10ml使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含黄50μg）。

（3）供试品溶液的制备取装量差异项下的本品，研细，取约0.75g，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇10ml，超声处理（功率250W，频率50kHz）10分钟，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。

（4）测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本品每袋含黄芩以黄芩苷（C21H18O11）计，不得少于21mg。

（三）不同产地黄柏药材的质量分析1仪器与试剂仪器：岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪，岛津SPD-10Avp紫外检测仪，AlltimaC184.6mm×250mm。试剂：乙腈（色谱纯），磷酸（分析纯），十二烷基磺酸钠（分析纯），盐酸小檗碱对照品（购自中国药品生物制品检定所）。样品：黄柏药材（分别由不同产地药材公司提供并鉴定）。

2对照品溶液和供试品溶液的制备2.1对照品溶液的制备精密称取在100℃干燥5h的盐酸小檗碱对照品适量，加流动相制成约5μg/ml的溶液，即得。

2.2供试品溶液的制备取本品药材粉末（过三号筛）约0.1g，精密称定，置100ml容量瓶中，加入流动相80ml，超声处理（功率250W，频率40kHz）40min，放冷，再用流动相补足至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3方法与结果3.1测定波长的选择取对照品溶液在200～450nm波长范围内测定其吸收光谱，结果表明其在346nm波长处有最大吸收，故选择此波长作为盐酸小檗碱的测定波长。

3.2色谱条件及系统适用性试验

固定相：AlltimaC184.6mm×250mm。流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每100ml加十二烷基磺酸钠0.1g）；流速：1.0ml/min；检测波长：346nm；柱温：40℃；进样量：20μl。理论塔板数按盐酸小檗碱计算应不低于4000。

3.3线性关系考察

精密称取经100℃干燥5h的盐酸小檗碱对照品5.15mg，置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，再取20ml用流动相稀释到100ml，精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、5.0ml、8.0ml、10ml分别至10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，按含量测定项下的方法进行测定；以峰面积（S）对浓度（C）做二元一次线性回归，得回归方程S=108730·C+9363.7（r=0.9998），结果表明：盐酸小檗碱浓度范围在1.03～10.3μg/ml之间峰面积（S）与浓度（C）线性关系良好。

图X-8

盐酸小檗碱对照品HPLC图图X-9

黄柏药材HPLC图3.4稳定性试验精密吸取供试品溶液20μl，分别在0、3、6、9、12h按上述色谱条件进样，记录峰面积积分值。得RSD为1.12%。3.5精密度试验精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液20μl，按上述色谱条件进样6次，记录峰面积积分值。RSD为0.98%。

3.6回收率试验精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加流动相制成一定浓度的溶液，分别精密移取等量，加入到已知含量的6份样品中，按供试品溶液制备方法制得6份供试品溶液，照含量测定项下的方法测定，计算回收率，数据见表X-4。

表X-4加样回收试验（n=6）3.7样品含量测定分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μl，按上述色谱条件，每个样品进样3次，取平均值，按外标法计算供试品中盐酸小檗碱含量，本品按干品计算，含小檗碱以盐酸小檗碱计算（C20H17NO4·HCL），得各产地黄柏药材中小檗碱的平均含量见表X-5。

表X-5各产地黄柏药材中小檗碱的含量测定结果表X-5实验结果表明，各产地黄柏药材中小檗碱含量存在差异，除产地地理环境的影响外，也受采收季节，树龄及加工方法等因素影响，而《中国药典》2005年版一部对黄柏药材中小檗碱的含量定在以盐酸小檗碱计（C20H17NO4·HCL）不得少于3.0%，可通过进一步研究为黄柏道地药材优良品系繁育和GAP基地建设奠定基础。4讨论二、高效液相色谱法在中药材定性鉴定中的应用

西青果与诃子均为使君子科诃子属植物的果实，前者为幼果，后者为成熟果实。西青果主要靠进口，品种仅是诃子属的单一品种。诃子的品种则较复杂，据文献报道，全世界约有200种，中国产8种，入药3～4种。（一）西青果与诃子的HPLC指纹图谱鉴别研究《中国药典》与进口药材部颁标准收载诃子有两种：一种是诃子（TerminaliachebulaRetz.），另一种是绒毛诃子（TerminaliachebulaRetz.var.tomentellaKurt.）的干燥成熟果实。

诃子的化学成分主要分为四类，即鞣质类、三萜类、酚酸类、脂肪族类化合物。鉴于鞣质为诃子类药材的主要化学成分，含量高达23％～37％，故采用高效液相色谱法对该类成分进行分析比较，为西青果与诃子以及不同品种诃子的鉴别提供依据。

（1）色谱条件色谱柱：LiChrospherRP-C18（4mm×125mm）色谱柱；流动相：以流动相A[0.05mol/L的磷酸溶液与0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液（1:1）]，流动相B（甲醇），流动相C（醋酸乙酯），梯度洗脱；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：280nm。（2）结果与分析各供试品的色谱图见图X-3及图X-4。为便于辨认和分析比较，将色谱图分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个区：第Ⅰ区包括1～3号峰（保留时间2～10.6min）、第Ⅱ区包括4～11号峰（保留时间11～22.5min）、第Ⅲ区包括12～20号峰（保留时间23～40min）。图X-3西青果和诃子的HPLC指纹图谱第I区和第II区色谱峰行为较相似，但第III区色谱峰行为相差较大，具有较显著的鉴别意义。

7种诃子的色谱图见图X-4，诃子、大诃子、小诃子及恒河诃子的峰较丰富，第I、II、III区均有较多峰，而其余3种仅有第I区特征峰〔1号峰、2号峰（没食子酸）、3号峰〕，第II、III区在同样进样量的情况下基本没有明显的色谱峰。

图X-47个品种诃子的HPLC色谱图图X-4所表示的7种诃子：(a)诃子(TerminaliachebulaRetz.)；(b)大诃子(T.chebulaRetz.f.maccrocarpa)；(c)小诃子(T.chebulavar.parviflora)；(d)恒河诃子(T.chebulavar.gangetica)；(e)绒毛诃子(T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.)；(f)毛诃子(T.abellirica)；(g)银叶诃子(T.argyrophylla)结论：不同品种诃子其鞣质类成分的种类及其含量存在差异，在HPLC色谱图中形成各自的“面貌”特征。以此为依据，可鉴别出不同品种诃子。

(二)不同产地半枝莲药材及其混淆品HPLC指纹图谱研究

1仪器与试药1.1仪器与试剂Waters1525高效液相色谱仪；Waters2487检测器（UV）；Empower工作站；SCQ-200超声波清洗器（上海声谱超声波设备厂）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。甲醇、乙腈为色谱纯（美国迪马公司）；水为二次重蒸水；其它试剂均为分析纯。

1.2对照品与供试药材样品表X-2半枝莲的来源野黄芩苷对照品；黄芩素对照品；汉黄芩素对照品；木犀草素对照品；半枝莲对照药材，由中国药品生物制品检定提供。

本试验收集了30种不同产地的半枝莲药材及其混淆品样品，来源见表X-2。

表X-2半枝莲样品的来源表X-2半枝莲样品的来源(续表)2实验方法2.1色谱条件色谱柱DiamonsilTMC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-乙腈50：50（A）-0.05磷酸（B）梯度洗脱，线性洗脱程序为0-36min，30-46A，36-40min，46-55A；40-45min，55A；45-65min，55-90A；65-75min，90-30A。检测波长为280nm，流速为1.0mL/min，柱温为35°C，进样量20μL。

2.2系统适用性试验取上述供试液20μL注入液相色谱仪记录色谱图按野黄芩苷峰计算理论板数约为6000，与其它色谱峰分离度大于1.5。2.3对照品溶液的制备取野黄芩苷、木犀草素、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成1mL中分别含0.1mg的混合溶液，即得2.4供试品溶液的制备取半枝莲药材，粉碎，过60目筛，取约0.2g，精密称定，精密加入60%乙醇25mL，超声提取1h，放冷至室温，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀。用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。

2.5精密度试验取6号半枝莲样品粉末，精密称定，按2.4项方法制备供试品溶液，重复进样6次，记录指纹图谱。将指纹图谱信号数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A），计算6次进样所得指纹图谱的相似度。结果表明，6次进样所得指纹图谱的相似度均高于0.97，符合指纹图谱测定要求，精密度良好。

2.6重复性试验取6号半枝莲样品粉末6份，精密称定，按2.4方法制备供试品溶液，分别进样，记录指纹图谱。计算6份样品所得指纹图谱的相似度。结果表明，6份样品所得指纹图谱的相似度均高于0.98，符合指纹图谱测定要求，重复性良好。

2.7稳定性试验取6号半枝莲样品粉末适量，精密称定，按2.4方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12，24h进样测定。计算24h内进样所得指纹图谱的相似度。结果表明，24h内进样所得指纹图谱的相似度均高于0.96，符合指纹图谱测定要求，稳定性良好。

3实验结果3.1不同产地半枝莲药材指纹图谱的建立取不同来源的半枝莲药材（1～24号样品），按2.4方法制备供试品溶液，进样，记录各样品在75min内的指纹图谱，14个共有峰被标定，见图X-5。图X-5

HPLC-UV色谱图

A.半枝莲样品B.对照品6.野黄芩苷12.木犀草素14.黄芩素15.汉黄芩素图X-6

为24批不同来源半枝莲药材的指纹图谱（图X-6）。图X-6

24批不同来源半枝莲药材的指纹图谱

S1～S24：1～24号样品S1：对照药材

S.野黄芩苷R.共有模式

取混淆品（25～30号样品），同法制备供试品溶液，进样，获得6批不同来源半边莲药材的指纹图谱（图X-7）。图X-7

6批混浠品半边莲的指纹图谱

S1～S6：25～30号样品

3.2相似度分析采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对从各地购得的半枝莲药材的指纹图谱进行数据处理，生成对照指纹图谱为对照图谱，计算各样品图谱与对照图谱的相似度。相似度计算结果见表X-3。根据相似度分析结果，24个半枝莲药材的相似度均在0.7以上。

表X-3不同来源半枝莲样品的相似度评价4讨论4.1图X-5标定了14个共有峰，为1到13及16号峰，指认了4个色谱峰，6号峰为参照物野黄芩苷，12、14、15号峰分别为木犀草素、黄芩素和汉黄芩素。图X-5

HPLC-UV色谱图

A.半枝莲样品B.对照品6.野黄芩苷12.木犀草素14.黄芩素15.汉黄芩素4讨论4.2表X-3可见，24个半枝莲药材的相似度均在0.7以上。其中10批在0.9以上，11批在0.8-0.9之间，只有3批在0.7-0.8之间。结果表明，各样品间相似度有一定差异。表X-3不同来源半枝莲样品的相似度评价4.3对样品图谱进行分析可以看出，各个样品中主要的色谱峰基本一致，但各峰的面积差异较大。可见，不同产地半枝莲成分组成基本一致，但各成分的含量