硒降低db小鼠血糖李奎

李奎中国农业科学院北京畜牧兽医研究所硒降低db小鼠血糖的分子机制研究汇报提纲

课题介绍主要进展成果统计后期计划经费决算课题介绍微量元素硒是动物和人体必需的营养元素，在一些重要的抗氧化酶和含硒蛋白中是必需的组成部分，在体内起着平衡氧化还原氛围的作用硒蛋白基因超家族：GPx、Dio、TrxR、SelP等至少25种硒蛋白课题介绍Osamu等报道在大鼠脂肪细胞中，硒与胰岛素一样可以增强葡萄糖的转运能力，硒和胰岛素都能够刺激与胰岛素敏感的葡萄糖转运蛋白(transporter，GLUT)的活性，从而加速葡萄糖的运输和降低机体血糖

Theinsulin-likeeffectsofselenateinratadipocytes.J.Biol.Chem.(1990)Clements等报道了在大鼠肌肉组织中，硒能够增强同化或异化反应通道而促进葡萄糖的分解和转运，但不能促进葡萄糖转化成糖原的形式

Insulin-likevs.non-insulinstimulationofglucosemetabolismbyvanadium,tungstenandseleniumcompoundsinratmuscle.LifeSci.(1996)课题介绍糖尿病db小鼠经补硒(Selenate，硒酸钠)处理后，改善了胰岛素敏感性，外周组织的胰岛素抵抗显著降低Compendiumoftheantidiabeticeffectsofsupranutritionalselenatedoses.JNutr.Biochem.(2006)STZ(链脲佐菌素)诱导的糖尿病大鼠补硒处理后，其抗氧化酶活性增强，血糖、糖化血红蛋白、脂质过氧化产物均下降，以及引起氧化应激的RAGE(糖化终末产物受体)和炎症反应的NFkB也下调，糖尿病症状缓解SeleniumDownregulatesRAGEandNFκBExpressioninDiabeticRats.BiolTraceElemRes.(2012)课题介绍研究证明，硒在糖尿病病理过程中，有降低血糖和调控胰岛素介导的代谢过程等拟胰岛素作用，但其具体机制仍不清楚本课题旨在通过基因表达谱芯片扫描、microRNA差异表达及其靶标预测和功能验证、蛋白质谱分析和组织切片分析等技术，从基因组学、表观遗传学、蛋白质组学和病理学等多方面深入探讨微量元素硒及其代谢通路参与影响糖脂代谢通路和胰岛素信号传导通路的过程，探索硒缓解糖尿病高血糖症状的分子机理课题思路主要内容及进展db小鼠模型的灌胃给硒处理及表型指标检测组织病理切片制备与观察肝脏、胰腺组织转录组表达谱芯片扫描肝脏组织microRNA芯片扫描和蛋白质谱分析综合分析，预测可能的代谢机理糖尿病动物模型构建db小鼠给硒处理小鼠模型：C57BL/KsJ-db/db，LepR自发突变

肥胖DM组(db-/-，n=30)、正常NC组(db+/+，n=20)

雄性♂，6周龄硒剂：硒酸纳(sodiumselenate，Sigma)水溶液剂量：按小鼠的LD50(~3.5mg/kgBW)的5%~25%剂量给药每天定时定点灌胃给硒和水，为期9周检测：每周测一次体重和空腹血糖实验结束后采全血，检测糖化血红蛋白和血清胰岛素

屠宰取胰腺、肝脏组织冻存、固定

db-/-db+/+体重与空腹血糖变化

体重变化基本不受影响DM组给硒处理组FBG显著下降NC组给硒处理不影响FBG正常值糖化血红蛋白变化糖化血红蛋白(HbA1c)可以稳定可靠地反映出一段时间的平均血糖水平，且受抽血时间，是否空腹，是否使用胰岛素等因素的干扰不大，因此可以很好地反映血糖被控制的情况db小鼠给硒组：血糖控制良好，显著下降正常小鼠对照组：

血糖正常稳定，给硒不影响胰岛素变化以DM肥胖小鼠为对照组(DM-C)，根据血清胰岛素变化，把血糖显著降低的DM硒处理组分成两组：胰岛素升高组(DMSe-H)、胰岛素降低组(DMSe-L)可能的机制：

胰岛素升高组(H)：改善胰岛素合成与分泌，提高血液胰岛素水平，降低血糖

胰岛素降低组(L)：改善了外周组织的胰岛素敏感性，促进血糖的利用，降低血糖DM-CDMSe-LNCDMSe-Hliverpancreas100µm100µm100µm100µm100µm100µm100µm100µmDM对照组（DM-C）胰岛细胞与周边组织界限不清，大小形态不规则

肝细胞脂肪变性和空泡化显著胰岛素升高组（DMSe-H）胰岛细胞显著增生，体积增大肝细胞脂肪变性和空泡化显著胰岛素降低组（DMSe-L）胰岛细胞与周边组织界限较清楚肝细胞脂肪变性和空泡化程度降低组织病理学分析转录组学芯片分析转录组表达谱芯片扫描：

Roche

NimbleGen设计：

DM-C、DMSe-H、DMSe-L三个组差异基因筛选数目统计：

肝脏胰腺上调下调上调下调DMSe-HvsDM-C65393621DMSe-LvsDM-C171400胰岛素升高组差异基因参与的细胞代谢通路图：肝脏细胞氧化还原反应脂肪酸合成代谢胰岛素升高组差异基因参与的细胞代谢通路图：胰腺胰岛素分泌调节和信号通路能量代谢细胞增殖胰岛素升高组肝脏和胰腺组织分子机制肝脏组织中，DMSe-H组筛选到Cyp3a16、Cyp3a41b、Cyp2c37、Es1、Serpina1b等细胞氧化还原反应的基因下调表达，Acacb、Agrp、Scd1、Pltp、Aldh1a2等脂肪酸合成代谢相关的基因显著上调表达，表现出氧化应激和脂肪酸合成代谢活动增强，脂肪沉积程度增大。表明肝脏组织的胰岛素抵抗加剧胰腺组织中，DMSe-H组筛选到Ins1、Ins2、Pdx6、Amy2b、Scgn等参与胰岛素分泌调节的基因表达上调，还有Aldh1a3、Ddc、Pde5a、G6pc2等能量代谢酶基因也上调，表明胰岛细胞合成和分泌胰岛素的能力增强了，表现在血清胰岛素水平升高，具有降低血糖作用胰岛素升高组与对照组DM-C相比胰岛素降低组差异基因参与的细胞代谢通路图：肝脏胰岛素信号通路糖脂分解代谢胰岛素降低组肝脏和胰腺组织分子机制肝脏组织中，

DMSe-L组筛选到IGF2、Pck1基因显著上调，参与胰岛素信号通路代谢，表明肝脏利用葡萄糖合成糖原能力加强；Txnip、Crispld2等抗氧化酶基因表达上调，显示肝脏抗氧化应激能力增强；Ugt2b38和Lipa、Mogat2等基因分别是肝糖分解代谢和脂肪酸分解代谢相关的酶表达下调，表明肝脏的脂肪沉积程度减弱在胰腺组织中，DMSe-L组未筛选出差异基因，表明胰岛细胞分泌胰岛素的能力无差异，而降低的胰岛素水平可能是因为外周组织对胰岛素的敏感性增强，对胰岛素的利用率增加胰岛素降低组与对照组DM-C相比表型监测、组织学和基因表达分析小结硒干预后，血糖得以控制的可能机制推测：胰岛素升高组：胰岛β细胞大量增殖，胰岛素的合成与分泌显著加强，通过高胰岛素促进外周组织对血糖的利用和储存，从而表现出血糖降低的结果胰岛素降低组：外周组织对胰岛素的敏感性得以改善，在较低水平的胰岛素作用下，即可实现对血糖的有效利用，表现出降低血糖；由于对胰岛素的需求降低，机体未出现高胰岛素血症，胰岛未显著增大表观遗传学和蛋白质组学分析蛋白质电泳图，差异蛋白点分析microRNA芯片扫描2-DIGE双向电泳质谱检测microRNA芯片扫描与蛋白质谱检测microRNA芯片结果发现，miR-144在DM小鼠喂硒后表达量显著上调，通过软件预测到其靶标之一为Aldh1a3Aldh1a3是乙醛脱氢酶超级家族成员之一，该家族中另外三名成员Aldh2、Aldh4a1和Aldh1L1在DM小鼠喂硒后与NC小鼠喂硒后出现差异表达下调转录组分析中，也检测到Aldh1a2和Aldh1a3差异表达PathwayAldh1a3和Aldh2存在于组氨酸代谢通路中，Aldh2和Aldh4a1同时在精氨酸和脯氨酸代谢通路中起作用几个蛋白之间有一定的关系，mir-144能够通过调控靶标Aldh1a3的表达，进而影响Aldh2

、Aldh4a1和Aldh1l1的表达，从而参与细胞氧化还原过程和调控机体糖脂代谢，起到预防和防治糖尿病的作用综合分析小结根据从各方面的研究结果推测，硒可能通过渗入其硒蛋白的氧化还原作用，增强机体抗氧化能力，清除自由基，修复胰岛细胞和外周组织，使胰岛素合成和分泌增加，同时还改善外周组织对胰岛素的敏感性，进而增强血糖的利用率，缓解了糖尿病症状后期计划I、微量元素硒可能促进胰岛细胞增生增大，并影响胰岛素的合成和分泌的体外验证：体外分离培养胰岛细胞，加硒处理，观察胰岛细胞的形态变化，监控胰岛素合成和分泌的情况，分子生物学检测胰岛素信号通路相关基因和蛋白之间的相互作用及变化，推测可能的作用机理后期计划II、转录组和蛋白组学水平均检测到乙醛脱氢酶的差异表达，表明其与硒存在某种联系在转录组和蛋白质组水平，检测GPx等硒蛋白和乙醛脱氢酶的时空表达谱，比较并寻找它们之间可能存在的相互联系，并通过体外细胞实验，探索它们在氧化还原过程中的相互作用机理糖尿病小型猪模型构建通过高脂高糖饲料诱导广西巴马小型猪，已获得了具有肥胖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、糖耐量受损、患脂肪肝和肝炎症的2型糖尿病小型猪个体已成功获得11β-HSD、hIAPP、Chop等单基因或多基因在胰腺组织特异过表达的几种转基因小鼠个体，并对其进行了全面的表型测定，为转基因糖尿病猪模型的构建奠定了研究基础获得成果2012年度成果统计发表论文20余篇，SCI收录12

篇

新申请专利6项，获授权专利6项，其中4项已发证2012年度国家科技发明二等奖

作为参加单位获北京实验动物行业协会奖一等奖代表性论文RenHY,ZhangNB,WangCQ,WangYF,LiK.Selenatepreventstype2diabetesbyregulatingproteinsinvolvedintheoxidation-reductionprocess.JMol.Med.(Contributing)获得成果ZhangJ,YingZZ,TangZL,LongLQ,LiK.MicroRNA-148apromotesMyogenicdifferentiationbytargetingtheROCK1gene.JBiolChem.2012.Jun.15;287(25):21093-101.(IF:4.773)荧光素酶检测结果表明miR-148a可以负调控ROCK1的3’UTR区域，表明ROCK1是miR-148a的候选靶标基因。miR-148a可在C2C12分化过程中抑制ROCK1的表达。抑制miR-148a的表达后，ROCK1的表达出现上调。干扰ROCK1的表达，会下调终末分化基因MHC的表达。证明ROCK1参与骨骼肌细胞的终末分化。获得成果HouXH,TangZL,LiuHL,WangN,JuHM,LiK.DiscoveryofmicroRNAsassociatedwithmyogenesisbydeepsequencingofserialdevelopmentalskeletalmusclesinpigs.PLOSONE.2012.vol7:e52123.(IF:4.092)miR-378主要在胎儿及出生后骨骼肌生长发育高峰期高表达，推测miR-378对肌肉的发育具有重要调控作用。qPCR结果表明，除了已报道的肌肉特异性表达miRNA（miR-1与miR-206），miR-378也在肌肉中高表达。获得成果MaL,YangSL,ZhaoWM,TangZL,ZhangTT,LiK.IdentificationandanalysisofpigchimericmRNAsusingRNAsequencingdata.BMCGenomics.2012.13(1):429.(IF:4.073)转录组测序揭示嵌合RNA在性别间转录差异不明显建立了“亲本基因通过转录工厂共享机制形成嵌合RNA”模型在猪中鉴定了676个嵌合RNA获得成果LiuN,XiaoB,RenHY,Ta