讲动物细胞大规模培养技术

第四篇

生物制品生产

第8讲

动物细胞生物制药第2节

动物细胞大规模培养技术1896192019872006为什么进行动物细胞大规模培养1962年开始动物细胞大规模培养尝试，目前已经成为生物制药的重要支撑技术。本讲主要内容1.适合大规模培养的细胞株2.动物细胞培养的生物反应器3.微载体及其培养特点4.动物细胞培养的影响因素与培养工艺

本讲关键问题1.了解动物细胞转化方法2.了解适合动物细胞大规模培养的生物反应器3.重点掌握微载体培养技术4.了解动物细胞培养的影响因素及灌注培养工艺第一部分细胞株与生物反应器

一

适合大规模培养的细胞株（一）细胞系(Cell

line)

是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细

胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群

体。第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。不能连续培养的为有限细胞系(Finite

cell

line)，能连续培养下去的为连续细胞系

(Infinite

cell

line)。（二）细胞株(Cell

strain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离

培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细

胞群，称细胞株。细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细胞，并使其在体外繁殖成为新细胞群体。毛细管法------形成单个细胞克隆的细胞群体有限稀释法（三）适合工业化生产的细胞株根据不同的分类标准，可以分为：1.原代细胞、传代细胞2.有限细胞系、无限细胞系（不具有接触抑制现象；理想的药物生产细胞）3.二倍体细胞、异倍体细胞4.融合细胞、转化细胞、基因工程细胞5.贴壁型、非贴壁型1.原代细胞鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、血液淋巴细胞1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎组织细胞生产

脊髓灰质灭活疫苗，开创了动物细胞培养进行生物

制药的先河。具有需要大量动物组织、成本高、费时费力等缺点。药物筛选、药理研究。2.传代细胞二倍体细胞：具有正常细胞的特点：二倍体染色体、

具有贴壁和接触抑制特性、无致瘤性。

有限细胞

系（传代次数一般都不超过50代）。WI-38：

1961年Wister

38研究所从女性高加索人的

正常胚肺组织中获得的一株人2倍体细胞系WI-38。

培增时间24h；贴壁生长；第一批获得批准用于生

产的二倍体细胞有对病毒敏感，第一个用于疫苗

（脊髓灰质灭活疫苗）生产。MRC-5：二倍体，成纤维，生长比WI-38快。3.转化细胞转化细胞：正常细胞由于受到病毒或其他促癌因子

的诱导而变成了具有癌细胞属性的细胞。特点如

下：无限增殖能力密度抑制丧失血清依赖性降低形态学改变：可悬浮生长核型改变：非整倍体细胞膜功能改变：运输能力增加、对化学致癌物抵抗力增加

致瘤性转化细胞一般具有永生性，但是永生性不一定成瘤。

一般转化细胞并不致瘤。致瘤性评价：接种到动物体内，发展形成肿瘤结

节，为生瘤阳性。随着对肿瘤发生机制等研究的深入，转化细胞于20

世纪80年代获得批准用于生产。

转化方法（1）细胞自转化细胞体外培养时，由于环境因子因素的影响，有时会发

生自发转化，由原来的二倍体核型变成多倍体/异倍

体核型，而获得永生化，失去接触抑制，可无限繁殖

传代。可能的因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污

染等，均有可能失去正常细胞特性，而发生遗传变异

甚至发生转化。因此为了维持二倍体细胞的正常细胞

特性，防止遗传变异和转化，应尽量早期冻存和减少

传代。（2）人工诱发转化1）诱发采用诱导剂使正常细胞发生转化。物理因素：如放射线、温度、电磁波、药物等化学因素：如甲基胆蒽、土醌80、7，12-二

甲基苯醌

（DMBA）、3-甲基胆蒽、甲基甲磺醌（MMS）、乙基

亚硝基脲（ENC），甲基硝基亚硝基胍类化合物

（MNNG）等。生物因素：如毒素、黄曲

霉毒素、病毒SV40、EB病毒、多发瘤病毒、逆转录病毒等。2）细胞系筛选诱变剂（致癌物）处理后的细胞群中进入转化发展阶段

的细胞仅是一小部分（大约5%），这些细胞称为癌前

细胞。癌前细胞由于失去了接触抑制，加上生长繁殖速度变快

，在局部癌前细胞的数量增多而堆积，最后形成了明

显

可见的“转化灶”。“转化灶”进行克隆分离和纯化后，

继续扩大培养，

即可形成稳定的传代细胞系。比二倍体减少1条(2n-1)或几条染色体的细胞称亚二倍体

常用细胞株CHO细胞(Chinese

hamster

ovary

cell)：从中国仓鼠卵巢

分离的细胞，亚二倍体，有多种突变株。贴壁生长，也

可以悬浮培养，对剪切力和渗透压改变有较高的忍受能

力。CHO细胞能表达糖基化蛋白药物：组织纤维蛋白溶酶原激活

剂(Tissue

plasminogen

activator，tPA)、促红细胞生

成素（Erythropoiefin，EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原

（Hepatitis

B

virus

surface

antigen,

HBsAg）、粒

细胞集落刺激因子（Granulocyte

colony

stimulating

factor,G-CSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。BHK-21细胞（Baby

hamster

kidney

cell）：是1961年英国从幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样，异倍体。常用于增殖病毒制备疫苗和重组蛋白(例如重组凝血因子VIII)。Vero细胞（Vero

cell）:是1962年日本从非洲绿猴肾中分离的细胞。成上皮型，异倍体，贴壁型，是最常用的大规模培养的动物细胞之一。

（4）融合细胞杂交瘤细胞：脾脏B细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞。无血清培养基中高密度悬浮生长。抗体药物生产。二

动物细胞大规模培养（一）定义动物细胞大规模培养（cell

large-

scale

culture）：是指在人工条

件下（设定pH、温度、溶氧等）

高密度大量增值的技术。培养流程：组织—消化—原代培养—传代培养

（细胞系与细胞株）—小规模培

养（转瓶等）—大规模培养（生

物反应器）—产品（二）转管/瓶培养系统

转瓶培养是在转管培养基础上为扩大培养量而改进的。转瓶或转管固定在旋转支架上，倾斜角度一般为5º-10º。细胞贴附在转瓶或转管的内表面，培养液随旋转而流动，细胞交替接触营养和空气，利于细胞吸收营养、进行气体交换。（三）动物细胞生物反应器培养

除了以人工诱变为目的的培养外，用于动物细胞培养的生物反应器的设计原则应该是尽量模拟培养物在生物体内的生长环境。

由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁、脆弱等，与微生物细胞培养不同，需要特别注意反应器结构设计以及特殊载体的选择。问题：1.如何设计生物反应器，降低动物细胞培养的剪切力损伤？2.如何满足细胞贴壁要求又能充分利用反应器空间体积？

1.动物细胞培养的生物反应器机械搅拌式：浆叶改造充气搅拌式：需要改造微载体培养：解决空间分布与贴壁，连续灌注培养中空纤维式：解决贴壁、营养气体有效吸收交换、

连续灌注培养

气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。笼式鼓气生物反应器这种类型的生物反应器搅拌速度一般都非低，尽量减少剪切力对细胞的影响。机械搅拌结合鼓气的生物反应器一次性培养袋在线分析技术中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜。主体是由微孔中空纤维管束制成的中空丝，纤维束由外壳包裹，因此可分为中空内腔与中空外腔两部分，每部分各有其进出口。新鲜培养液从中空内腔导入。气体在管体部分通过，其中一部分则均匀地扩散至壳体内部。中空纤维生物反应器柱式中空纤维生物反应器板框式中心灌流式特点模拟细胞在体内生长的三维状态。

既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。细胞如果是附壁性的，则附着在纤维外壳表面，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化冲出；若是非附壁性的，应采用微滤材料将其截留在反应器内而让培养液排出。优点：无剪切力影响，高密度培养，传质效率高。缺点：容易堵塞，价钱昂贵。小结1.动物细胞生物制药常用的细胞株2.动物细胞培养的生物反应器：传统反应器改造、

中空纤维反应器补充文献：第二部分微载体培养与动物细胞培养影响因素（一）微载体培养技术微载体（Microcarrier）：是直径60-250μm的适用

于贴壁依赖型细胞生长的微粒。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。1967年，维茨尔（Van

Wezel）开发了微载体系统。微载体系统将传统的一维平面贴附扩展为三维立

体贴附，摆脱了传统的培养瓶（管）培养限制。

同时，微载体使利用生物反应器进行动物细胞

大规模培养成为可能，既能满足动物细胞的贴

壁要求，又能充分利用生物反应器的内部空间。微载体特点1.好的生物相容性：无毒无害，有好的黏附性，一般带正电荷2.大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一3.良好的传质性能4.强的机械性能：重复利用、保护细胞5.好的热稳定性：高压灭菌

制备微载体的材料1.人工合成聚合物聚甲基丙烯酸-2

羟乙酯（PHEMA）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯酰胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等。2.天然聚合物及其衍生物明胶、胶原、纤维素、甲壳质及其衍生物、海藻酸盐功能材料2004，35卷，增刊微载体分类1.实心微载体优点：易于细胞在表面贴壁，机械强度高，容易接种操作缺点：细胞浓度低；细胞容易受剪切力、搅拌、碰撞等影响；细胞易老化脱落。2.多孔微载体优点：比表面积更大，使细胞免受机械损伤，得到的细胞浓度高，可降低血清用量，可以采用高的搅拌速度和通气量缺点：容易产生营养传递障碍，积聚代谢副产物。

（1）微载体培养微载体培养动物细胞经黏附贴壁、生长和扩展成单层

三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微

载体表面的贴附是关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载

体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概

率和亲和性，也与培养基组成、搅拌等相关。

影响贴壁的因素贴壁主要是靠静电引力和范德华力。取决于细胞与

微载体表面理化性质和微载体接触概率有关。电荷：一般细胞在进入生理pH值时，表面带负电荷。

若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞

贴壁速度。培养基组分：添加血清有助于细胞贴壁。提供促接触和伸展因子。搅拌：不能仅依靠大的搅拌速率保证接触概率。在

贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，

待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转

速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，

最大速度75r/min。其它因素：培养基偏酸或偏碱、微载体不洁等不利条件都不利于细胞贴壁。一种微载体产品（Fibra-Cel）人胚肾细胞HEK293人上皮细胞——SoloHill微载体上的生长微载体对细胞生长具有显著的影响问题：微载体培养如何收获细胞？接种细胞传代呢？胰蛋白酶消化将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合，实现细

胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体表面的技

术。优点：（1）避免了细胞收获与微载体再生过程，方便、高效。（2）防止细胞调亡：通过定期更换微载体也能为细

胞的分裂生长提供了新的生长空间，在长期培养

过程中保持细胞活力，延长了细胞寿命，提高了

细胞分泌物的产量。球传球(bead

to

bead)技术优点1.模拟了体内三维生长环境，减轻了接触抑制，可以多层生长。2.很好地解决了生物反应器的空间分布问题，单位体积培养液的细胞产率高；培养系统占地面积和空间小；劳动强度小；放大容易，使大规模培养动物细胞成为可能。3.把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可以稍加改造利用传统生物反应器。4.接种与收获方便；可循环、连续收获与培养，培养基利用率较高。（二）动物细胞培养的影响因素1.细胞凋亡（1）有毒物质或抑制因子产生氨：来自培养基+代谢，积聚影响细胞生长。乳酸：来自细胞的糖代谢，抑制乳酸脱氢酶，抑制糖酵解，能量产生减少，抑制细胞生长。甲基乙二醛：脂类、氨基酸的代谢产物，对细胞有潜在的损伤作用。（2）营养成分耗尽如谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因，而且凋亡一旦发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞在无血清、无蛋白培养基中