本科生《P》第三章载体

《PrincpleandTechnologyofGeneticEngineering》

《基因工程原理》Professor,Dr.Degang

Zhao(赵德刚)GuizhouKeyLaboratoryofAgriculturalBioengineering,

CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity

E-mail:dgzhao@

1

第三章基因工程载体教学目的与要求：1）掌握基因工程常用载体特点2）掌握基因克隆的基本方法2

第一节载体的定义

3载体（Vector）是指在寄主细胞内能自我复制，并能够作为运输载体将重组DNA分子转移到寄主细胞的DNA分子。（ADNAmoleculethatiscapableofreplicationinahostorganism,andcanactasacarriermoleculefortheconstructionofrecombinantDNA.）基因克隆载体：能承载外源DNA带入受体细胞，并在其中自我复制以维持和扩增外源DNA的一类DNA分子，又称为DNA克隆载体。基因表达载体Requireinavector:

CloningsitesOriginofreplicationSelectablemarkerSafety载体应该具备记到主要条件，以pBR322为例进行说明：1克隆位点:在DNA分子合适的位置有1到多个克隆位点，可供外源DNA片段插入克隆载体DNA分子中。2复制起点：具有复制起点，外源DNA插入载体后，仍可由复制起点起始复制过程。3筛选标记基因：具有用于选择克隆子的标记基因。4安全性：克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，且不能转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。pBR322为例说明负筛选法：首先用不含AP和TC的培养基，两种都长，然后选取一些菌落，在含AP的培养基上培养，不长的，说明有外源基因插入AP位点，到不含AP和TC的培养基的培养基上找到相应的点。第二节质粒载体（Plasmidvectors）

6一、质粒的定义质粒（Plasmid）:

一种存在于细菌、酵母等寄主细胞中染色体外的裸露双链DNA分子（acircularDNAmolecules,foundinnature,inbacteriaandsomeyeasts.pDNA）。大小一般可从1千多个碱基到100多kb，多数在10kb左右。拷贝数：一个寄主细胞中某种质粒的数量与染色体数量之比。一般寄主细胞只有一套染色体。按照拷贝数的多少，可以将质粒划分为严紧型质粒和松弛型质粒。当拷贝数在1-10之间时，通常称为严紧型质粒。很多大质粒是严紧型质粒。当拷贝数多于10个时，通常称为松弛型质粒，小质粒一般是松弛型质粒。严紧型质粒和松弛型质粒之间没有严格界限。某种质粒对于某种寄主来说，拷贝数一般是一定的，拷贝数的存在是因为质粒上存在cop基因，它可以指令寄主细胞合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数后，阻遏物也达到一定量，就阻遏质粒进一步复制。NumberofCopies：一个寄主细胞中某种质粒的数量与染色体数目的比值。Basedonthenumberofcopiesoftheplasmidfoundinthehostcell:lowcopynumberplasmids,stringent(严紧型)controlofDNAreplicationHighcopynumberplasmids,relaxedplasmid(松弛型)按照是否含有trans基因将质粒分为结合型质粒和非结合型质粒。Trans基因是一种可以指令寄主细胞产生鞭毛，合成细胞表面物质，促使寄主细胞与其他细胞相接合，导致遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞。我们把含有trans基因的质粒称为结合型质粒，把不含有trans基因的质粒称为非结合型质粒。在基因工程中我们一般选用什么样的质粒？松散型、非结合型

质粒的命名：p，plasmid表示质粒，随后的两三个大写字母表示谁发现和发明了该质粒，数字表示质粒分离的次数或者构建的一系列质粒的编号。例：pBR322二、质粒克隆载体质粒经改造后即可成为基因工程载体。如前述pBR322，载体需有克隆位点和标记基因。标记基因种类很多：1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）

a.

抗生素抗性基因:Apr，Tcr

，Kanr，G418r，Hygr

，Neorb.重金属抗性基因:Cur，Znr

，Cdrc.代谢抗性基因:抗除草剂基因

2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）。主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3）生化标记基因。其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ,GUS,CAT。葡萄糖苷酸酶基因（GUS）该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。荧光素酶基因荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌（Photobacterium

fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。发光蛋白质基因发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。

β—半乳糖苷酶基因（lacZ

和lacZα）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。

β—半乳糖苷酶基因的优点:

a.

酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观

b.

lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性

c.lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大三、构建质粒克隆载体的基本策略（Slightlymoreexoticplasmidvectors）1能在转化的受体中进行有效复制、有较多拷贝数（松弛型的质粒ori）。2克隆位点：尽可能多一些，至少有一个。可用MCS连杆，MCS是指含多种内切酶识别序列的多克隆位点（multiplecloningsite），又称多聚接头（polylinker）。3筛选标记基因：选择标记区内有合适的克隆位点，当外源DNA插入时，标记gene将失活而成为筛选的标识。4构建的质粒克隆载体应尽可能小。大于15kb的plasmid转化效率明显。5根据需要，使构建的质粒克隆载体组装各种“元件”（小DNA片段）。如插入启动子，终止子。Puc18/19克隆载体：1.2.68kb2.ori来源于松弛型质粒ColE1的复制起始位点，可在大肠杆菌E.ColiHB101,E.ColiC600等细胞中高效复制（DH5α）。3.含报告基因LacZ，lacZ取代了pBR332中的Tcr基因。

PLacZα

LacZβ

转录

翻译

αβpUC18

BamHI片段重组DNA分子转化E.coli外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落为重组子，兰色菌落为原载体利用LacZ基因筛选重组子pUC18/19中lacZ序列筛选：lacZ来源于乳糖操纵子，含有启动子、调节因子和β-半乳糖苷酶的α-肽基因（lacZ）。该基因产物在含IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）培养基培养时，菌落是蓝的。阳性克隆（转化子）是白色的。pUC系列质粒载体由Messingetal.构建，具有三个显著特点：1.分子量小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大2.易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα3.多克隆位点区

1)多克隆位点成对地存在于pUC18和pUC19中，位点排列顺序相同，但方向相反,有利于外源DNA的克隆和定向插入

2)产生不同末端规律排列:两端限制酶位点产生5’-突起端（EcoRI和HindⅢ),与之相邻的两个限制酶位点产生3’-突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI),中央四个限制酶位点产生5’-突起端或平端。这种排列方式十分有利于插入DNA片段的单向缺失和缺失片段的回收。pUCfamilyPolylinkerormultiplecloningsite[MCS]pUCm-T载体(pUCm-TVector):1线性化的载体，2载体每条链的3’端带有一个突出的T。第三节大肠杆菌的噬菌体载体（BacteriophagevectorsforuseinE.Coli)一、噬菌体的定义（Whatarebacteriophages）噬菌体是吃细菌的病毒颗粒（viruses,“eaterofbacteria”）。CapsidtailGene3proteinCoatproteinDNAPhagesfallintothreemaingroups:

(1)tailless(2)headwithtail

(3)Filamentous（细丝状）Geneticmaterial:(1)single-strandedRNA(2)double-strandedDNA病毒由DNA（orRNA）、外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。进入宿主细胞后，利用宿主细胞的合成系统进行DNA（orRNA）复制和壳蛋白的合成。DNA和RNA不能共存于同一种病毒中。噬菌体有严格的宿主专一性，限制了其作为载体使用的范围。温和噬菌体（Temperatephages

）：插入宿主染色体DNA→随着宿主细胞的复制而复制→溶原阶段（LysogenicCycle）烈性噬菌体（Virulentphages）：不插入宿主染色体DNA→自主复制→溶菌阶段（LyticCycle）二、λ噬菌体载体（Vectorsbasedonbacteriophageλ）1.λDNA的特点1)λDNA：λ噬菌体中的DNA，线状，48.5kb，编码46个基因，集中于头部。2)cos位点：左右两端各12个核苷酸组成的5’-粘性末端。两者核苷酸序列互补，λDNA在包装前是线状的，在包装后是环状的。3）46gene：成簇排列。不是所有gene都是生长必需的。

Capsidcomponents衣壳合成从A到J基因——左侧区

Integration&excision分裂合成（阴影区为基因操作中非必需部位）

Early(late)regulation早、晚调节

DNAsynthesisDNA合成

Lysis

释放4）有56种限制性核酸酶的酶切位点5）λ噬菌体的生长途径有两种。LysisofcellandreleaseofmaturephageparticlesInductionLysogenic

responeCelldivisionLytic

responepSuchasultravioletlightAssembledorpackaged5）λ噬菌体的生长途径有两种。λ噬菌体载体感染E.coli→λDNA注入细胞→（溶菌阶段）→cos位点连接→复制→在R和S蛋白作用下细胞破裂λ噬菌体载体感染E.coli→λDNA注入细胞→（溶原阶段）→在宿主细胞int基因作用下插入宿主染色体→复制紫外线2.λ噬菌体作为克隆载体的依据①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。②λ噬菌体可承载大的外源DNA。可承载的外源DNA为λDNA的75%-105%（即38-51kb）且λDNA上有20kb的区域对λ噬菌体并非必需，可取代或缺失。3.λ噬菌体载体类型λ噬菌体载体有两种类型，即插入型载体（Insertionvectors）和替换型载体（replacementvectorsorsubstitutionvector）。1.插入型载体（Insertionvectors）：多用于cDNA构建文库。1）免疫功能失活型如λgt10，其左、右臂之间有一个CI基因，该基因应用了imm434免疫区段。该区段完全时，出现浑浊的噬菌斑——λ噬菌体进入溶菌阶段；该区域被破坏时，CI基因失活，结果产生清晰的噬菌斑。可以通过形态学上的差异将两者分开。2)β-半乳糖苷酶失活型如Charon16A，λgt11。2.替换型载体（replacementvectorsorsubstitutionvector）常用于基因组文库构建在左右臂之间有填充物，可以被外源DNA所取代，中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA序列将被替换掉。Stuffers和polystuffer区可以被替换掉。EMBL4：当用两端酶切位点时，中间也可以用其他酶切割一下，以防原噬菌体片段退火。Charon40：中间含有多节段区（polystuffer），MCS是反向重复序列。两者可容纳外源DNA能力9-22kb之间。

使用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：①用恰当限制性酶消化λ载体，除去基因组中可替代的部分②将上述所得λDNA臂同外源DNA相连接③重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体图3-8置换型载体组成示意图图3-9λEMBL3载体结构示意图Phagemids(phasmids):thephagefunctionsareexpressed,forexample,λZAPfamilybystrategene.二、凯伦噬菌体载体凯伦噬菌体载体（Charonvector）是F.RBlattner在1977年在λ噬菌体基础上发展出来的一种特殊噬菌体载体。Charon：是古希腊神话中一名老摆渡工，专门负责在斯蒂克斯河（Riverstyx）上，运送亡灵到阴间。

容纳能力感染效率质粒：nkb-nbp

低，0.1%转化率

λ噬菌体：大片段，nkb-23kb高几乎每个颗粒都有100%感染率图3-11λGEM-II载体结构示意图三、M13噬菌体

M13噬菌体是一种丝状（filamentous）噬菌体，内含有环状、单链DNA分子（“+”链DNA）,长为6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息，可分为10个区。还有一个长507个核苷酸的基因间隔区（IS区），从第5489个核苷酸到第6005个核苷酸。M13的复制起点定位在基因间隔区内，但IS区内有些核苷酸序列即使发生突变、缺失或插入外源DNA，也不会影响M13DNA的复制，这为M13DNA构建克隆载体提供了条件。可编码三类蛋白质：复制蛋白质（基因Ⅱ，Ⅴ，Ⅹ）形态发生蛋白质（基因Ⅰ，Ⅳ，Ⅺ）结构蛋白质（基因Ⅲ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ）M13mp18M13噬菌体周期：①M13噬菌体通过鞭毛吸附，感染雄性大肠杆菌，M13噬菌体的“+”链进入细胞内，以此为模板，复制互补的“-”链DNA。由此产生的双链M13DNA称为复制型DNA（RF-DNA）。RF-DNA按一般环状双链DNA进行复制。②当细胞内RF-DNA达到近200个拷贝时，则RF-DNA中的“+”链DNA被单链特异的DNA结合蛋白结合，阻止“+”链DNA的复制合成。结果，细胞内只能以“-”链为模板不断复制合成新的“+”链DNA。③新合成的“+”链DNA立即被积累在细胞内的壳蛋白包装成新的噬菌体颗粒，并不断挤出宿主细胞。（单链，“+”链→存在于噬菌体中，双链DNA存在于宿主细胞中。）M13噬菌体周期的特点：①增殖过程不会导致宿主细胞的溶菌生长，被感染的细胞一个世代可以释放1000个子代噬菌体。M13包装DNA分子的能力可达M13DNA本身的6倍。②制备的M13DNA，单、双链均可转染大肠杆菌受体细胞，因此M13DNA作为载体时，不必进行体外包装就可以直接转染受体细胞。第四节原核生物应用的其他载体一、cosmid质粒载体①λ噬菌体特点：两端部少于280bp，且含有cos位点，可以插入36.4-51kb长度的DNA；②质粒克隆载体特点：不用包装即可转导。克隆能力一般不超过10kb，载体大小一般也在10kb以下，是环状双链DNA.cosmid质粒载体特点：将λ噬菌体载体的cos位点和质粒克隆载体相结合，大约4-6kb长，能够容纳47kb的外源DNA。Cosmids:Thevector

bemadeupofplasmidsequencesjoinedtothecossitesofphageλ,about4-6kbinlength,canaccommodateclonedDNAfragmentsuptosome47kbinlength.二、噬菌粒载体M13噬菌粒载体（M13噬菌粒和质粒）优点是可以用来制备克隆基因的单链DNA。不足之处：A.插入外源片段后，遗传稳定性下降，外源DNA越大越严重。B．外源片段只按一种方向插入；C．接受外源DNA能力有限，小于1500bp。噬菌粒载体特点：A.分子量一般都比M13载体小，约3000bp，易于操作；B.可得到10kb的外源DNA单链序列；？C.有质粒和噬菌体的复制起点，因此在大肠杆菌寄主中可以按正常双链质粒DNA分子形式复制；在有辅助噬菌体时可以按M13形式复制；D.可以从噬菌体直接测序。例：pMB1replicon（复制子）:①体外包装，感染，质粒型复制可容纳外源DNA片段：30-45kb；②基因组文库中使用。Genomemapping（酵母人工染色体亚克隆）。第五节真核细胞应用的载体

1Ti

质粒（Ti：Tumor-induce肿瘤诱发）根癌农杆菌(Agrobacterium

tumefaciens)与Ti质粒的G-菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crowngalltumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征：1）不需要补充植物激素便可进行离体培养；2）合成肿瘤特有的化合物—冠瘿碱(opine)，能专一的为根癌农杆菌所利用。这两个特征由Ti质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。Ti质粒存在于根癌农杆菌中，大小为90-150x106道尔顿,结构是环状双链DNA,160-250kb，具六个功能区：①致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素；②冠瘿碱（opine）合成区：参与冠瘿碱合成；③冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解；④Ti质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移；⑤毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体；⑥DNA复制区：参与Ti质粒DNA复制。Agrobacterium

oriOpinesynthesisT-DNALBRBCytokininsynthesisAuxinsynthesisVirulencegeneConstructionofTiplasmid合成氨基酸衍生物-冠瘿碱Anxinsynthesisgene：合成细胞分裂素合成吲哚乙酸Cytokininsynthesisgene：Opinessynthesisgene：Ti质粒类型（由Ti质粒所产生的冠瘿碱种类而定）有：①章鱼碱类(octopine)；②胭脂碱类(nopaline)；③农碱类(agropine)T-DNA

：Ti质粒中与植物染色体结合的部位称为T-DNA。T-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的25bp重复序列，T-DNA整合不具特异性，右侧25bp重复序列对T-DNA的转移至关重要。2.Ti质粒载体的中间载体（intermediatevector）Ti质粒作为载体的问题：1）太大，不易转化2）无适合克隆位点3）T-DNA致瘤区合成植物生长素和细胞分裂素，使转化细胞成瘤状，不能成为完整植株Ti质粒载体的中间载体由几部分组成：A.适合E.Coli和A.Tumfaciens自主复制和选择用标记基因B.适合于植物细胞选用的标记基因C.一段来自天然Ti质粒的部分T-DNA序列（提供同源重组）D．1-2个来自T-DNA边界的25bp重复序列E．用于表达外源基因的DNA序列（如启动子、终止子序列）Modified

TiplasmidDelete：

genesoftheproductionofbacterialfoodandofplanthormonesInsert：

selectablemarkergenepCAMBIA1301质粒T-Border(right)Nos3’Gus35S5’NcoI35S5’Hyg(R)T-Border(left)35S3’HinDIIISalIBamHIEcoRIBstEIIpCAMBIA130111837bpLacZ植物根部羟基乙酰丁香酮乙酰丁香酮植物细胞单链-DNAFormationofcrowngall

植物根部受伤部位分泌乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酸诱导Ti质粒vir基因及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达vir基因产物将Ti质粒上T-DNA单链切下根瘤菌染色体上的操纵子表达产物与单链T-DNA形成复合物复合物转化植物根部细胞

3．Ti质粒的转移过程T-DNAIntegratingtoplantgenomeT-DNAIntegratingtoplantgenome

二、酵母应用的质粒载体以大肠杆菌质粒为基本骨架，具有酵母的DNA复制起始区，选择标记，有丝分裂稳定区和外源DNA插入位点。Yeastepisomalplasmids（YEps

附加型质粒）：在pBR322中插入酵母筛选标记ura3和2μ质粒DNA片段（复制起始部位和rep基因），拷贝数高，稳定。以附加体形式在真核细胞中复制。（yeast2μplasmid,mayreplicateautonomouslyorintegrateintoachromosomallocation.）

Yeastintegrativeplasmids（YIps

综合型整合质粒）：含有酵母的筛选标记ura3基因，但缺乏酵母的复制起始位点，所以，它只有整合到酵母染色体中才能复制。（YipsaredesignedtointegrateintothechromosomeinasimilarwaytotheYepplasmid.）

Yeastreplicativep