文献研读李梵

文献研读汇报汇报人：导师：时间：2014年12月12日IF:6.8152汇报内容研究背景材料方法实验结果结果讨论我的思考3研究背景TIR：Toll/Interleukin-1receptorNB：nucleotidebindingsiteLRR：leucine-richrepeatdomainsPCD：programmedcelldeath1.目前世界上的酿酒葡萄品种主要为欧洲种，而欧洲种为霜霉病和白粉病的易感品种。目前主要依赖农用化学品抗病，而依赖农用化学品抗病危害环境。通过转基因的方法来获取抗病基因并转入感病植株是一种优良的办法。2.圆叶葡萄具有抗霜霉病、抗白粉病、抗虫害、高产和高品质的特点。可作为抗病基因来源。3.圆叶葡萄第12条染色体上有7个TIR-NBS-LRR类基因。有文献指出植物（如拟南芥，莴笋）中这类基因为抗病基因。材料方法BAC：bacteriaartificialchromosome

1.圆叶葡萄和欧洲种葡萄的种间杂交植株部分可繁殖后代F1，F1经回交的后代BCs对霜霉病和白粉病具有抗性。2.以BC5:3294-R23为材料，构建BAC文库，并从中筛选含有标记（CB314.315与CB292.294）的基因片段，在此基础上进行后续功能验证及其他研究。3.霜霉菌和白粉病病菌侵染植株后都会引起细胞程序性死亡（PCD），叶面产生坏死斑。实验结果6RGAs物理定位图RGAs抗白粉病功能验证RGAs抗霜霉病功能验证MrRUN1/MrRPV1核质分布5.MrRUN1和MrRPV1产生多个剪切片段RGA：resistancegeneanalog.抗病基因同源序列实验结果1同源序列氨基酸一致性百分比(b)MrRGA的结构，包括TIR，NB，ARC和10-12个LRR，区别在于LRR的个数(c)预测的MrRGA蛋白的特征(d)同源序列氨基酸一致性百分比，均高于80％②TIR-NB-LRR类基因结构及同源性实验结果1红圈内的是编码TIR-NB-LRR蛋白的基因,是候选基因

①MrRGAs遗传图和物理图定位实验结果2抗病葡萄ShirazCarignanTempranilloPortan①MrRGA基因抗白粉病的功能验证转RGA10葡萄农杆菌介导法将候选基因转入易感葡萄Shiraz,Tempranillp,Portan,Maccabeu,Carignan中,以表皮细胞48hpostinoculation后PCD面积百分比为标准衡量？实验结果2①MrRGA基因抗白粉病的功能验证MrRGA10在其中四种易感葡萄相对高表达实验结果2MrRUN1对白粉病病菌分离菌A的抗性MrRUN1对白粉病病菌分离菌B的抗性②MrRUN1对不同白粉病菌分离菌的抗性结论：MrRUN1对白粉病病菌分离菌A和B无抗性AB来源于纽约，分别为LNYM和NY137实验结果2MrRUN1对白粉病病菌分离菌Musc4的抗性来源于Georgia②MrRUN1对不同白粉病病菌分离菌的抗性总结：对不同分离菌具有不同的抗性，研究中仅对白粉病病菌分离菌Musc4无抗性。结论：MrRUN1对白粉病病菌分离菌Musc4无抗性？实验结果3①MrRGAs基因抗霜霉病的功能验证用霜霉菌喷洒转基因葡萄及抗病葡萄叶盘，用OIV（国际葡萄与葡萄酒组织）发病指数评价6dpi时的得病率，主要指标是孢子生成浓度和PCD面积。OIV得分5以上为抗霜霉病。抗病葡萄转RGA8葡萄？实验结果3①MrRGAs基因抗霜霉病的功能验证通过孢子囊的生成情况进一步验证MrRGA8的抗霜霉病性能，由图中可以看出转RGA8葡萄显示出较强抗性结论：MrRGA8对霜霉病具有抗性实验结果3①MrRGAs基因抗霜霉病的功能验证结论：MrRGA8基因使得葡萄对霜霉病具有抗性，命名为MrRPV1hyp：hyphal菌丝生成实验结果3②MrRPV1对不同霜霉菌分离菌的抗性MrRPV1对霜霉菌A抗性结论：MrRPV1基因使得葡萄对霜霉菌A具有抗性霜霉菌A来自于法国5实验结果3②MrRPV1对不同霜霉菌分离菌的抗性MrRPV1对霜霉菌B抗性结论：MrRPV1基因使得葡萄对霜霉菌B有抗性霜霉菌B来源于北美实验结果3②MrRPV1对不同霜霉菌分离菌的抗性MrRPV1对霜霉菌SL抗性结论：MrRPV1基因使得葡萄对霜霉菌SL有抗性总结：MrRPV1基因使得葡萄对不同分离菌都有抗性实验结果4MrRUN1和MrRPV1在细胞中的分布由于NSL的存在，推测MrRUN1和MrRPV1蛋白分布在核中，用GFP结合MrRUN1蛋白和MrRPV1蛋白判断其分布。可发现MrRUN1：GFP主要位于核中（图b）；而MrRPV1：GFP在核质中均有分布（图d）。但MrRUN1和MrRPV1中把保守结构域NLS从RKRRR变为RTSRR，分布就主要为质分布（图c和e）。因此NSL可能是起作用的那部分。，实验结果5通过克隆和测序证明基因由于不同的剪切机制转录成4种不同的转录本，每一种都有可能一种产物MrRUN1和MrRPV1产生多个剪切片段讨论1尽管是对两种不同的菌——霉菌和卵菌有抗性，MrRUN1/MrRPV1高度同源（86%氨基酸一致），区别仅仅在于LRR的个数不同。这并不是特例。有文献指出，番茄中Rx/Gpa2类R基因（88%氨基酸一致）分别对病毒和线虫有抗性。此外，不能排除其他五条全长度的MrRGAs可能单独或是与其他基因如MrRUN1/MrRPV1一起具有抗病功能。MrRGAs遗传图和物理图定位MrRGA基因抗白粉病的功能验证抗病葡萄感病葡萄Portan，转RGV10基因Portan感病葡萄Tempranillp，转RGV10基因Tempranillp感病葡萄Shiraz，转RGV10基因Shiraz讨论：转基因葡萄株系抗病性均不如抗病株系。这很可能是因为其他RGAs的存在使得BC5:3292-R23具有更强的抗白粉病性。讨论2讨论3MrRGA基因抗霜霉病的功能验证问题：与抗白粉病相反，MrRPV1转基因植株比BC5：3294-R23有更强的抗霜霉病性。why?查阅文献进行后续研究。讨论4MrRUN1/MrRPV1基因编码的不同蛋白质在抗病或是在PCD信号传导过程中起到不同的作用，主要是由于这些蛋白质在细胞中的分布不同，一部分在细胞核内，一部分在细胞质中。分布在细胞质中的蛋白质可能在cytoplasmiccelldeath过程中起作用。MrRUN1和MrRPV1在细胞中的分布讨论5TIR-NB-LRR类基因需要全长的和截短的ORF（开放阅读框）。烟草中的N基因和拟南芥中的RPS4基因在没有截短的转录转录本的情况下就无法表现出完全的抗性。MrRUN1/MrRPV1基因转录编码全长的蛋白质和3种推断的截短的蛋白质，现在正在研究MrRUN1/MrRPV1基因转录成全长的cDNA的过程，并研究3种推断的被截短蛋白质在抗病过程中的作用。MrRUN1和MrRPV1产生多个剪切片段我的思考文章亮点葡萄中第一个被验证的抗病基因可以补充的地方1实验中提到MrRU