定量PCR原理及实验方法

定量PCR原理及实验方法方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。RT-qPCR是由三个步骤组成：反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;扩增:用PCR的方法扩增cDNA;检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Keyporint):分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计反转录反应的非标准化影响试验的稳定性数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：新鲜、冰冻、甲醛固定的样品整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞总RNA或者mRNARNA反转录成cDNA的不同的引发策略不同的酶以及酶的不同组合变异系数、灵敏度多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。RNA质量评价现在RNA定量的程序很多。最近EMBOqPCRcourse(http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28)比较了用Ribogreen,AgilentBioAnalyser,spectrophotometer,NanodropandtheBioRadExperion来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。RNA质量RNA质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。AgilentBioanalyser/BioRadExperion微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28SrRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。我们使用oligodT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3’5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’5’的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。QRT-PCR抑制物的组成QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应，高度的抑制还导致假阴性的结果。抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG.是否有抑制物的评价体系：通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况用细菌检测临床样品的抑制通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况反转录反应系统RT和PCR单一酶系统RT和PCR分离的酶系统RNA逆转录引物的选择引物主要有三种：随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物.2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA.而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。PCR优化PCR优化主要有：引物的浓度建议使用SYBRGreenI和EvaGreen进行扩增和溶解曲线的测试笔者建议的操作流程：靶的选择和试验设计针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件.RTPrimerDB(http://medgen.ugent.be/rtprimerdb),PrimerBank(/primerbank/index.html)RealTimePCRPrimerSets()如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考：最广泛使用的商业化的软件BeaconDesigner()DIY的软件PrimerExpress如果BeaconDesigner无法得到您说需要的结果，或者获得到设计方案的备选数目不够的话，可以选择Sigma-Genosys)的服务方案，详细周到一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序：/products/probe_design.asp您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR引物设计简介DNA引物长度:15-25个碱基GC含量:50%左右如果引物的与AT区域富集结合，可以考虑用LNA替换几个碱基，较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争•，分之内杂交，倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低，因此我们选择引物二聚体的AG为负值，即:<10kcal/mol.没有连续的G/C.引物探针的保存一般遵循以下原则：正向和反向引物保存在-20度，浓度为10mM或者10x工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度，最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。输入靶序列，用BLASTn在/blast进行比对检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。在RT步骤时，用(/applications/mfold/rna/form1.cgi)!具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60%或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是的扩增时间缩短gDNA污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3’区域量PCR除可以对样品的初始浓度进行准确定量外，还有其它多种丰富的应用。还包括基因表达调控情况的分析、等位基因的分析等，那么这些功能是如何在一台定量PCR仪上实现的呢？下面将进行一一介绍。利用标准曲线对样品的初始浓度进行定量：用已知浓度的标准品绘制标准曲线来对未知样品定量，首先要有一组稳定的标准品。标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必需保证稳定。一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。以Rotor-Gene3000的操作为例，以标准曲线对未知样品定量是默认的分析方法。软件可在反应尚在进行时就对结果进行分析，结果随着反应的进行可实时更新，当然也可以等反应完全结束后再进行分析。点示“Analysis”，弹出分析框，默认分析功能即为“Quantitation”，点击“Show”，软件即自动给出包括标准曲线（包括R值，R平方值，扩增效率、标准曲线公式等）、标准化的荧光曲线、各样品计算浓度（包括标准偏差、变异系数等）在内的结果。若是使用SYBRGreenI法，还可进行熔解曲线分析，以判断退火温度是否合适，产物中是否有引物二聚体的影响。对于SYBRGreenI的客户，我们建议一定要在最后做一步熔解曲线的分析，这对于反应条件的优化和结果的正确判定都有着非常重要的作用。同样，点击“Analysis”，在分析窗口中选择“Melt”，点击“Show”，自动给出分析结果。完成了所需的分析之后，如还需给出分析结果报告，点击“Analysis”边上的“Report”选项，选择报告模板，软件自动给出报告。利用定量技术进行基因型分析研究：常用的分析方法有两种，一种是Taqman探针法，一种为FRET探针法（又称Hyb探针），运用以上两种方法进行基因型的分析需要一台有多通道的荧光定量PCR仪。Taqman探针分析基因型是以扩增信号的有无来判定，而FRET探针则根据扩增后片段熔解温度的不同来判定。以下为用Taqman探针判断基因型的实例：这里，突变型的探针以FAM荧光素标记，野生型的探针以VIC荧光素标记，检测时分别同时检测了FAM通道和VIC通道的荧光情况。这里，3、4号样品只在FAM通道有信号，而在VIC通道里无信号，表明这两个样品为突变型；1、2号样品在FAM通道无信号，在VIC通道有信号，表明这两个样品为野生型；而5、6号样品在两个通道都有信号，但荧光强度恰为其它样品的一半，说明这两个样品为杂合型。并且，我们可以在软件里将不同的通道定义为不同的基因型，软件会根据不同样品在各个通道的荧光情况，自动对各个样品的基因型做出判定。以下为用FRET方法分析基因型的实例：如上图，荧光探针与突变型完全匹配，而与野生型存在一个碱基的错配，因而打开这两组双链所需的能量就不同，具体体现在熔解温度的差异上，因而突变型的样本有较高的熔解温度，而野生型的样品熔解温度相对较低。在图中，5号样本熔解温度较低，为野生型；2号样本熔解温度较高，为突变型；而1、3、4号样品在高温和低温处都出现了熔解峰，则它们为杂合型。并且用户还可以将不同的峰定义为不同的基因型，软件可根据用户的定义自动给出未知样品的基因型。如上图表格中所示。利用相对定量的方法分析目的基因的上下调情况：基因表达调控研究中，常用的相对定量方法主要有两种，Delta-deltaCt法和双标准曲线法。由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。我们分别来看看以上两种相对定量分析方法的特点和应用。Delta-deltaCt：公式：由Delta-deltaCt的公式可以看出，该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个基因扩增效率一致。ComparativeDelta-deltaCt法的特点、注意事项及实际应用：ComparativeDelta-deltaCt法的一大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。用ComparativeDelta-deltaCt法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用ComparativeDelta-deltaCt法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。下面是某科研用户用Delta-deltaCt进行相对定量分析的实例：首先，该客户分别做了目的基因和看家基因的确标准曲线，根据软件自动给出的M值判断该方法的可行性：如下图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因(GeneofInterest)和看家基因(HousekeeperGene)做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M值分别为-3.525和-3.467，两者的差值＜0.1，因此，这组看家基因和目的基因可以用ComparativeDelta-deltaCt法进行相对定量。确定这两个基因可以用Delta-deltaCt法分析后，用户扩增了其待测样品的目的基因和看家基因。经软件自动分析后，给出分析结果，如下：我们看到，在该客户的实验中，以样品A为对照组，软件自动组出了样品B和C的目的基因相对于样品A的表达情况。这种方法对于样品量大，但研究的基因数目相对较少的客户特别有用，因为一旦条件优化好之后就无需再做标准曲线，节约了试剂和样品量，实验操作也相对简单。双标准曲线法：双标准曲线法考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率。双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用：双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-deltaCT法那样对实验进行严格的优化。其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以