人教版教学教案生物：专题五DNA蛋白质技术(新课标选修一)

专题5 DNA和蛋白质技术【课题目标】本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNADNA的物理化学性质，理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。【课题重点与难点】课题重点：DNA的粗提取和鉴定方法。课题难点：DNA的粗提取和鉴定方法。【学问要点】DNA的物理化学性质，尤其是DNA的溶解性；2.二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。[学习导航]DNADNA的提取、蛋白质的提取、DNA片段的扩增等，是开展分子生物学争辩的根本技术。本专题将从根底入手，学习DNA的粗提取、PCR技术和血红蛋白的提纯。学习这些技术，不仅能够帮助学生初步了解分子生物学的根本试验方法，而且能够稳固必修课中学习的有关DNA和蛋白质的理论学问。3个课题相对独立，没有严格的先后挨次。课题1的操作难度不高，学生比较简洁获2的操作难度也不高，但PCR技术的原理是难点，学生要充分利用教材的图文资料，并且在教师的引导下进展试验操作。课题3的操作难度比较大，所以学生肯定要在教师的细心指导下完成操作。课题1 DNA的粗提取与鉴定[导学诱思]提取DNA的方法提取生物大分子的根本思路是 。对于DNA的粗提取而言，就是要利用 、 等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。DNA的溶解性DNA这一特点，选择适当的盐浓度就能使充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以到达分别目的。5—1是DNANaCl溶液中的溶解度曲线，请依据曲线图，思考：①在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？②如何通过把握NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？此外，DNA不溶于 溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分别。DNA对酶、高温存洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解 ，但是对 没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在 以上才会变性。洗涤剂能够瓦解 ，但对DNA没有影响。DNA的鉴定 在 条件下，DNA遇 会被染成 色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。试验设计试验材料的选取 但凡含有 的生物材料都可以考虑，但是使用 的生物组织，成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的试验材料：鱼卵、猪肝、菜花〔花椰菜、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培育基的大肠杆菌思考：哺乳动物的红细胞的特点？裂开细胞，猎取含DNA的滤液动物细胞的裂开比较简洁，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中参加肯定量的 ，同时用 搅拌，过滤后收集滤液即可。假照试验材料是植物细胞，需要先用 溶解细胞膜。例如，提取洋葱的 DNA时，在切碎的洋葱中参加肯定的和 ，进展充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。思考：①为什么参加蒸馏水能使鸡血细胞裂开？②参加洗涤剂和食盐的作用分别是什么？③假设研磨不充分，会对试验结果产生怎样的影响?④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？去除滤液中的杂质 阅读课本的三个方案，思考：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？方案二与方案三的原理有什么不同？DNA的析出与鉴定将处理后的溶液过滤，参加与滤液体积、冷却的，静置，溶液中会消灭 ，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。20ml的试管，各参加物质的量浓度为的NaCl5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各参加4ml的。混合均匀后，将试管置于中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变。操作提示以血液为试验材料时，每100ml血液中需要参加3g ，防止 。参加洗涤剂后，动作要、，否则简洁产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。参加酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要，以免 ，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。二苯胺试剂要 ，否则会影响鉴定的效果。结果分析与评价[疑难点拨]DNANaCl溶液浓度的关系：NaCl0.14mol/L时，随浓度的上升，DNANaCl溶液浓度高0.14mol/L时，随浓度上升，DNA的溶解度上升。制备鸡血细胞液时，要在颖的鸡血中参加柠檬酸钠的缘由制备鸡血细胞液时，要在颖的鸡血中参加抗凝剂——柠檬酸钠，防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反响，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大削减，血液便不DNA后，要弃出上层清液——血浆。提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是肯定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于试验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；其次步是DNA的释放和溶解，这一步是试验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即依据DNA的溶解DNADNA进展鉴定，这是对整个试验的结果的检测。在DNA的析出的步骤中用到玻璃棒搅拌时，留意动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。5．盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞裂开以后释放出的DNA，简洁被玻璃容器吸附，由于细胞内DNADNA就会更少。因此，试验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以削减提取过程的DNA的损失。[典例解析]本试验中有三次过滤：⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液0.14mol/LNaCl溶液⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液以上三次过滤分别为了获得〔 〕A含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液B含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液C含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布上的DNAD含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液答案：A解析:用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜裂开，释放出核物质，此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质的滤液，这种滤液必需经过试验中其他步骤得相继处理，方能得到较纯的DNA。DNA0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低，成丝状粘稠物，可经过滤留在纱布上。【课本问题答案和提示】〔一〕旁栏思考题为什么参加蒸馏水能使鸡血细胞裂开？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的裂开(细胞膜和核膜的裂开)，从而释放出DNA。参加洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。假设研磨不充分，会对试验结果产生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响试验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。6．方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分别。〔二〕练习答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是肯定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于试验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；其次步是DNA的释放和溶解，这一步是试验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即依据DNA的DNADNA进展鉴定，这是对整个试验的结果的检测。答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是由于，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很简洁失活；并且蛋白质的空间构造多种多样，理化性质各不一样，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能依据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。[课堂演练]一、选择题〔10个〕在争辩DNA的基因样本前采集来的血样需要蛋白水解酶处理然后用有机溶剂除去蛋白质用蛋白水解酶处理血样的目的是〔D 〕A.除去血浆中的蛋白质 B.除去染色体上的蛋白质 C.除去血细胞外表的蛋白质D.除去血细胞中的全部的蛋白质，使DNA释放，便于进一步提纯与析出DNA粘稠物有关的表达，不正确的选项是〔C 〕操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出D.当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度相当于0.14mol/L3．洗涤剂能够瓦解〔B ，但对DNA没有影响。A.细胞壁 B.细胞膜 C.细胞核 D.细胞质4．在沸水浴的条件下，DNA遇〔D 〕会被染成蓝色。A.斐林试剂 B.苏丹Ⅲ染液 C.双缩脲试剂 D.二苯胺5．在DNA提取过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是〔B 〕A.不易裂开 B.削减提取过程中DNA的损失C.增加DNA的含量 6．以下操作中，对DNA的提取量影响最小的是〔B 〕A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分裂开，放出DNA等核物质B.搅拌时，要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌C.在“析出DNA粘稠物”时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增加D.在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却E在DNA的溶解和再溶解时，要充分搅拌DNA的粗提取中，将与滤液体积相等的、冷却的〔D ，静置—3mi，溶液中会消灭白丝状物。A.0．9%的NaCl B.0.14mol/L的NaCl溶液C.质量分数15%的HCl D.体积分数为95%的酒精溶液以血液为试验材料时，需要向血液中参加〔C ，防止血液凝固。醋酸钠 B.龙胆紫 C.柠檬酸钠 D.醋酸洋红在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断参加蒸馏水的目的是〔C 〕加快溶解DNA的速度 B.加快溶解杂质的速度 C.削减DNA的溶解度加快DNA析出 D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出去除滤液中的杂质时，直接在滤液中参加嫩肉粉，利用嫩肉粉中的〔C 〕分解蛋白质。A.胃蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.木瓜蛋白酶 二、非选择题〔3个〕提取鸡血中DNA时，要除去血液中的上清液，这是由于什么？NA提取鸡血中的DNA时，要除去血液中的上清液。填写本试验完成以下试验操作时所用试剂。⑴提取鸡血细胞中核物质⑵溶解核内DNA：2mol/LNaCl溶液中的DNA⑷DNA粘稠物的再溶解⑸提取杂质较少的DNA白色乳状丝状物⑹DNA的鉴定2mol/LNaCl2mol/LNaCl95的酒精⑹二苯胺关于DNA缘由是什么？请答复以下问题：⑴鸡血细胞中红细胞 ，家鸡属于鸟类，陈代谢旺盛，因而血液中 细胞树木较多，可以供给丰富的 。⑵试验前由教师制备血细胞液供同学们做试验材料，而不用鸡全血，主要缘由是。⑶生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较便利，假设他们按试验要求完成试验步骤后，结果是 ，这是由于这些动物和人一样，成熟的红细胞中 ，但假设改用动物肝脏做试验材料，试验能顺当进展。这是由于 。⑷假设选用动物肝脏做试验材料，在提取之前，最好增加 程序，使组织细胞更易分别。答案：⑴含细胞核；红DNA ⑵鸡血细胞液DNA相对含量⑶很难提取DN；无细胞核；肝细胞有细胞核⑷研磨【学问拓展】二苯胺鉴定DNA的化学原理DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。研磨液中几种药品的作用Tris/HCl:供给缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态〔Tris为三羟甲基氨基甲烷。EDT〔乙二胺四乙酸二钠：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞裂开后DNA酶降解DNSD〔十二烷基磺酸钠：可以使蛋白质变性，与DNA分别。【教学反思】课题2 多聚酶链式反响扩增DNA片段【课题目标】本课题通过尝试PCR〔DNA多聚酶链式反响〕技术的根本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学试验方法，理解PCRPCR【课题重点与难点】课题重点：PCR的原理和PCR课题难点：PCR参与的组分解旋酶DNA母链DNA复制中的作用合成子链的原料参与的组分解旋酶DNA母链DNA复制中的作用合成子链的原料DNA聚合酶引物DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为，而磷酸基团的末端称为。DNA聚合酶不能开头合成DNA，而只能 ，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是 。在DNA的复制过程中，复制的前提是 。在体外可通过把握来实现。在 的温度范围内，DNA的双螺旋构造将解体，双链分开，这个过程称为 。PCR利用了DNA的 原理，通过把握温度来把握双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高，导致DNA聚合酶失活，后来 的DNA聚合酶的觉察和应用，大大增加了PCR的效率。PCR反响需要在肯定的缓冲溶液中供给： ， ，， ，同时通过把握温度使DNA复制在体外反复进展。PCR的反响过程PCR一般要经受循环，每次循环可以分为、和三步。从其次轮循环开头，上一次循环的产物也作为模板参与反响，并且由 延长而成的DNA单链会与结合，进展DNA的延长，这样，DNA聚合酶只能，使这段固定长度的序列成指数扩增。试验操作在试验室中，做PCR通常使用 ，它是一种薄壁塑料管。具体操作时，用微量移液器按PCR反响体系的配方在中依次参加各组分再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可。操作提示为避开外源DNA等因素的污染，PCR试验中使用的 、 、 以及蒸馏水等在使用前必需进展 。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢溶化。在微量离心管中添加反响成分时，移液管上的枪头要 。[疑难点拨]PCR技术简介PCR是一种体外快速扩增DNADNA上百万份的DNADNA含量太低而难以对样品进展分析争辩的问题，被广泛的应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。细胞内参与DNA复制的各种组成成分及其作用①解旋酶：翻开DNA双链②DNA母链：供给DNA复制的模板③4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的3端开头连接脱氧核苷酸〔引物是一小段DNA或RNADNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR20—30个核苷酸〕DNA的合成方向DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA3，端，而磷酸基团的末端称为5，DNA聚合酶不能从头开头合成DNA3，端延长DNADNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA3，端开头延长DNA链，DNA5，3，端延长。PCR的反响过程PCR〔90oCDNA解聚为单链、复性〔温度下降到50oC左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合〕和延长〔温度上升到72oC左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，依据碱基互补配对原则合成的DNA链〕三步。从其次轮循环开头，上一次循环的产物也作为模板参与反响，并且由引物Ⅰ延长而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进展DNA的延长，这样，DNA聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。PCR技术与DNA的复制PCRDNA复制在体外反复进展。PCRDNA复制，所以有关PCR反响的题目与DNA复制的原理一样，计算方法也大体一样。例如：PCR反响中的目的2nnDNA30次循环后反响物中大约有10〔230〕[典例解析]]一个由15N标记的DNA分子，放在没有标记的环境中培育，利用PCR循环5次后标记的DNA分子总数的〔 〕A 1/10 B 1/5 C 1/16 D1/25答案：CDNA分子利用PCR5次后产生的DNA2nDNA的复制是半保存复制，其特点是：形成的DNA双链，一条是来自亲代DNA分子的母链，另一条是形成的子15N标记的DNA分子复制后，其标记的两条链就分别进入两个子代DNA分子中，这样两个子代DNA分子被标记了。以后均是在没有标记的环境中培育，不管经过多少次复制，最DNAnDNA2/2n,即1/2n-1。【课本问题答案和提示】练习提示：绘图可参考教科书中图5-9。PCR2nnDNA3010〔2n=230=1073741824)。提示：PCR引物是依据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学试验阅历，感兴趣的学生可以参考《分子克隆试验指南》〔见本专题参考书目〕，书中有详尽的论述。【课堂演练】一．选择题〔10个〕DNA分子复制时，解旋的两条链中〔C 〕A仅一条作为复制模板B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子C两条链作为模板并复制出两个一样的DNA分子D两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重结合为原来的双螺旋分子，两条链结合成一个全的DNA分子以下关于DNA复制过程的正确挨次是〔D〕①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母链为模板进展碱基互补配对⑤子链与母链盘旋成双螺旋状构造A①③④②⑤ B①④②⑤③ C①③⑤④② D③①④②⑤3.以下各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有〔A 〕①DNA复制②RNA复制③转录④翻译⑤逆转录A①②③④⑤ B①②③④ C①②③⑤ D①③④⑤4.试验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是〔D 〕①酶②游离的脱氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦适宜的温度⑧适宜的酸碱度A①②③④⑤⑥ B②③④⑤⑥⑦ C②③④⑤⑦⑧ D①②③④⑦⑧利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？〔A 〕A 2 B 4 C 8 D 16，关于DNA分子的表达中，正确的选项是〔C〕A.DNA的两条链是极性一样，同向平行 B.DNA的两条链是极性一样，反向平行C.DNA的两条链中极性不同，反向平行的 D.DNA的两条链是极性不同，同向平行假设PCR反响中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反响物中大约有多少这样的DNA片段〔B 〕A 215 B 230 C 260 D 231DNA的合成方向总是〔C 〕延长。A从DNA分子的左端向右端 B从DNA分子的右端向左端C从子链的5，端向3，端 D从子链的3，端向5，端要使PCR反响在体外的条件下顺当地进展，需要严格的把握〔C 〕A氧气的浓度 B酸碱度 C温度 D大气的湿度DNA分子经PCR反响循环一次后，合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与〔 〕A模板母链一样 B非模板母链一样 C两条模板母链一样D两条模板母链都不一样二．非选择题〔2个〕PCR技术是把某一DNA片段在试验条件下，合成许很多多一样片段的一种方法，利用这种技能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段到这种技术。请结合有关学问，答复有关此技术的一些问题：⑴PCR技术能把某一DNA片段进展扩增，依据的原理是：⑵在试验条件下，DNA分子进展扩增，除了所要扩增的DNA片段处，还需要 和 、 等条件。DNA16035个，假设让该DNA分子扩增三次〔即复制三次〕至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是 和 个。答案：⑴DNADNA分子中碱基的互补配对⑵四种脱氧核苷酸、能量、酶⑶245、31515NDNA15N标记。然后将被15N标记的大肠杆菌作为亲代转到一般培育基中，生殖两代。亲代、第一代、其次代大肠杆菌DNA的状况如下图。⑴第一代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息与亲代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息完全一样的缘由是 。⑵假设将其次代大肠杆菌的DNA分子总量作为整体1，其中，带有15N的其次代大肠杆菌DNA分子约占总量的 %。⑶假设将其次代大肠杆菌的DNA115N标记的其次代大肠杆菌的DNA含量〔脱氧核苷酸单链〕约占总量的 %1N标记的DNA双链的每条链为模板50⑶25【参考资料】琼脂糖凝胶浓度与DNA分别范围的关系凝胶浓度要依据DNA16srRNADNA15004-11％〔1g/100mL，下同〕的凝胶浓度。4-1DNA0.30.60.70.91.21.512.0

kb)5～601～200.8～100.5～70.9～60.2～30.1～2核酸电泳缓冲液核酸电泳缓冲液有三种，分别是Tris—硼酸(TBE)、Tris—乙酸(TAE)和Tris—磷酸(TPE)。在上述三种缓冲液中：TBETPE缓冲液容量高，对DNA的分别效果好，但TPEDNA沉淀。TAE液的缓冲容量低，价格较廉价。本试验选用的是TBE缓冲液。缓冲液EDTADNAPCR10倍浓缩的TBETris 108g EDTA9.3g硼酸 55g1000mLpH8.0～8.210倍。核酸电泳的指示剂与染色剂核酸电泳常用的指示剂是溴酚蓝，溴酚蓝在碱性条件下呈蓝紫色。指示剂一般与蔗糖、甘油或400DNA内；能够在电泳中形成肉眼可见的蓝紫色指示带，从而帮助推测核酸电泳的速度和位置；能够使样品呈现蓝紫色，使加样操作更便利。核酸电泳后，需要染色才能在紫外线下观看到带型。最常用的染色方法是溴化乙锭染色法。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，有剧毒，因此操作时要格外留神。EB可嵌入DNA在紫外线激发下，能发出红色荧光。染色的方法有两种。一种是在凝胶电泳液中参加EB，使其终浓0.5μg/mL0.5μg/mLEB10～15min。当凝胶染色过深时，可以将凝胶放入蒸馏水中浸泡30minPCRPCRTaqDNA活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够；等等。当试验中消灭假阴性的状况时，应首先在原来扩增的产物中再参加TaqDNA5～10TaqDNA用活力高、质量好的酶。同时，在提取DNA模板时，应特别留意避开提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。尽管TaqDNAPCRDNA3′端与靶基因互补。PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要缘由。此外，样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。为了避开因污染而造成的假阳性结果，PCR操作时要留意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等【教学反思】课题3 血红蛋白的提取和分别【课题目标】子的根本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分别生物大分子的根本原理，为今后学习运用这些技术打下根底。【课题重点与难点】课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。【导学诱思】凝胶色谱法路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。相对分子质量不同的蛋白质分子因凝胶色谱法也称做 ，是依据 分别蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由 构成的多孔球体，在小球体内部有很多贯穿的通道，相对分子质量路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分别。缓冲溶液缓冲溶液的作用是 。缓冲溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物体内进展的各种生物化学反响都是在一定的pH下进展的，例如：血浆的pH是 ，要在试验条件下准确模拟生物体内的过程，必需保持体外的pH与体内的根本全都。电泳电泳是指 很多重要的生物大分子如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在肯定的pH下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分别。两种常用的电泳方法是 和 ，在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于以及 等因素。蛋白质的提取和分别蛋白质的提取和分别一般分为四步： 、 、 和 。样品处理血液由 和 组成，其中红细胞最多。红细胞具有的特点。红细胞中有一种格外重要的蛋白质 ，其作用是，血红蛋白有个肽链组成，包括 ，其中每条肽链围绕一个，磁基团可携带 。血红蛋白因含有呈现红色。红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要准时承受 分别红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透亮的，将下层暗红色的倒入烧杯，再参加 ，缓慢搅拌，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 ，说明红细胞已洗涤干净。血红蛋白的释放在和作用下，红细胞裂开释放出血红蛋白。分别血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透亮的 ，第2层为白色薄层固体，是 ，第3层是红色透亮液体，这是 ，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透亮液体。透析取1mL的血红蛋白溶液装入中将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的中，透析12h。透析可以去除样品中 的杂质，或用于更换样品的。凝胶色谱操作第一步要制作 ，其次步要 ，由于 ，所以装柱前需要依据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有存在。由于气泡会 ，降低分别效果。第三步是。【疑难点拨】1．凝胶色谱法分别蛋白质的原理凝胶色谱法也称为安排色谱法，它是依据分子量的大小分别蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有很多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进展两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规章的集中运动，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较简洁进入相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最终流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状构造，相对分子质量大的分子通过这种网状构造上的空袭时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分别。2．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进展蛋白质的分别的意义哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分别时可以通过观看颜色来推断什么时候应当收集脱液。这使血红蛋白的分别过程格外直观，大大简化了试验操作。电泳的作用及其原理蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的用待分别样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、外形等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而到达对样品进展分别、鉴定或提纯的目的。【典例解析】用凝胶色谱法分别蛋白质时，分子量大的蛋白质〔D 〕A路程较长，移动速度较慢B路程较长，移动速度较快C路程较短，移动速度较慢D路程较短，移动速度较快解析：在小球体内部有很多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质简洁进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。【课本问题答案和提示】〔一〕旁栏思考题你能从凝胶色谱的分别原理分析为什么凝胶的装填要严密、均匀吗？答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有很多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较简洁进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最终流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分别。假设凝胶装填得不够严密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流淌次序，影响分别的效果。〔二〕练习答：凝胶色谱法也称为安排色谱法，它是依据分子量的大小分别蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有很多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进展两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规章的集中运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较简洁进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最终流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状构造，相对分子质量大的分子通过这种网状构造上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分别。pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物〔缓冲剂〕溶解于水中制得，调整缓冲剂的配比就可制得不同pH缓冲溶液的作用是维持反响体系的pH不变。在生物体内进展的各种生物化学过程都是在准确的pH下进展的，受到氢离子浓度的严风格控。为了在试验室条件下准确地模拟生物体内的自然环境，就必需保持体外生物化学反响过程有与体内过程完全一样的pH。答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。很多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分别样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、外形等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而到达对样品进展分别、鉴定或提纯的目的。答：血红蛋白提取和分别的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分别、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分别；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最终经聚丙烯酰胺凝胶电泳进展纯度鉴定。答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分别时可以通过观看颜色来推断什么时候应当收集洗脱液。这使血红蛋白的分别过程格外直观，大大简化了试验操作。[课堂演练]一．选择题1．凝胶色谱法是依据〔B 〕分别蛋白质的有效方法。A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度2．缓冲液的作用是：在肯定范围内，抵抗外界的影响来维持〔B 〕根本不变。A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷〔B〕的电极移动。A一样 B相反 C相对 D相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的〔A 〕与氧气的运输有关。A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中〔C 〕的含量最多。A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先参加抗凝血剂〔D 。A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是〔C 〕A无色透亮的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液D其他杂质的暗红色沉淀物二．非选择题电泳利用了待分别样品中各种分子 以及 、 的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分别。答案：带电性质的差异；分子本身的大小；外形的不同你能描述血红蛋白分别的完整过程吗？答案：血红蛋白提取和分别的程序可分为四大步。包括：样品处理、粗分别、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；在经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分别；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最终经聚丙烯酰胺凝胶电泳进展纯度鉴定。参考资料聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度试剂的配制N,N29%〔29g/100mL，下同〕的丙烯1N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。由于丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中会分别缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一反响是由光或碱催化的。因此在每次使用前，应核实溶液的pH不7.0；并且应将配制好的溶液置于棕色瓶中，室温贮存，每隔几个月须重配制。十二烷基硫酸钠〔SDS〕用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。用于制备分别胶和浓缩胶的Tris缓冲液1.5mol/L、pH8.8Tris〔分别胶缓冲液〕；1mol/L、pH6.8Tris〔浓缩胶缓冲液〕。TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺)TEMED胺与双丙烯酰胺的聚合。过硫酸铵用去离子水配制10%的过硫酸铵溶液。过硫酸铵供给驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制颖液。Tris—甘氨酸电泳缓冲液25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1SDS。样品处理液50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。染色液0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。脱色液1010%的冰醋酸。必需在通风橱内或通风处进展。TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进展电泳操作时肯定依据试验要求和步骤，在教师的指导下完成。操作时要戴好一次性手套。电泳依据厂家说明书安装电泳用的玻璃板。SDS4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris2.5mL，10SDS0.1mL，10%的过硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，0.5cm)，再在胶液面上留神注入一层水〔约高2～3mm〕，以阻挡氧气进入凝胶溶液。分别胶聚合完全后〔30min〕，倾出掩盖水层，再用滤纸吸净残留水。SDS2.7mL，300.67mL，1.0mol、pH6.8Tris0.5mL，10SDS0.041mL，100.04mL，TEMED0.004mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分别胶上，并马上在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应留意避开气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其布满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。1∶1体积比参加样品处理液，1003min，以使蛋白质变性。浓缩胶聚合完全后〔30min〕，留神移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各参加Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必需设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。按挨次加样，加样量通常为10～25μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞裂开后(即进展凝胶色谱分别之前)的样品和凝胶色谱分别之后的样品。将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分别胶后，把电压15V/cm，连续电泳直至溴酚蓝到达分别胶底部上方约1cm从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔〔第一槽〕凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1～2h3～10h，其间需屡次更换脱色液至背景清楚。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内使其不会降低染色强度。为保存永久性记录，可对凝胶进展拍照，或将凝胶枯燥成胶片。通过本试验的电泳图谱，可以观察提取的血红蛋白的纯度并不是很高。【教学反思】专题学问归纳根底学问：提取DNA的方法试验材料的选取试验设计裂开细胞，猎取含DNA的滤液去除滤液中的杂质DNA的粗提取与鉴定DNA的析出与鉴定以血液为材料要防止血液凝固DNA和蛋白质技术操作提示棒搅拌时，动作要轻缓二苯胺试剂要现配现用结果分析与评价课题延长PCR原理根底学问 PCR的反响过程多聚酶链式反 试验操作应扩增DNA 操作提示片段 结果分析与评价课题延长凝胶色谱法血红蛋白的提根底学问缓冲溶液取和分别电泳样品处理试验操作凝胶色谱操作SDS—聚丙烯酰凝胶电泳红细胞的洗涤试验操作色谱主填料的处理凝胶色谱柱的装填蛋白质的分别结果分析与评价课题延长专题学问检测一、选择题DNA的溶解度最低时，NaCl的物质的量浓度为〔C〕A.2mol/L B.0.1mol/L C.0.14mol/L D.0.015mol/L2．DNA不溶解于〔C 〕A.NaCl溶液 B.KCl溶液 C.酒精溶液 D.MgCl2溶液3．鉴定DNA的试剂是〔D 〕A.斐林试剂 B苏丹Ⅲ染液 C.双缩脲试剂 D.二苯胺试剂4．在向溶解DNA得NaCl溶液中，不断参加蒸馏水的目的是〔C 〕A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解杂质的速度C.减小DNA的溶解度加快DNA析出 D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出在DNA的粗提取过程中，初步析出DNA和提取较纯洁的DNA所用的药品的浓度及其名称分别是〔B 〕①0.1g/ml柠檬酸钠溶液②2mol/LNaCl溶液③0.14mol/LNaCl溶液④体积分数为95%的酒精溶液⑤0.015mol/LNaCl溶液⑥0.04mol/LNaCl溶液A.①③⑤ B.③④ C.②④ D.②③④关于DNA的粗提取与鉴定试验的表达哪项是错误的〔C 〕离心沉淀的血细胞中加水是为了提取DNANaCl2mol/L时，DNA溶解向溶解的DNA烧杯中加蒸馏水是漂洗DNAD.离心后除去血液中的上清液是为了除去杂质以下关于试验现象的正确描述是〔C 〕向盛有果糖溶液的试管中参加斐林试剂，产生转红色沉淀纸层析法分别叶绿体中的色素时，滤纸条上最宽的色素带呈黄绿色C.DNA的粗提取中，其次次参加蒸馏水并搅拌，能析出含DNA的黏稠物D.同一叶片受SO2危害的挨次是先叶柄后叶片关于