分子生物学实验操作方法与技巧

分子生物学与生物化学实验

操作、设计与技能电泳技术李刚副教授contents影响迁移率的几大因素2电泳的原理1低熔点琼脂糖的优点3不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围4电泳缓冲液5contents电泳步骤7凝胶载样缓冲液6凝胶中DNA定量的方法8两种核酸染色方法9电泳的主要用处10contents电泳切胶小窍门12

核酸回收的几种经典方法11电泳的原理带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。利用带电样品分子（DNA、RNA、蛋白质等）在电泳装置中的支持介质上（琼脂糖、聚丙酰酰胺等）迁移率（带电荷颗粒在一定电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离）的不同而将样品中不同大小的分子分离开。影响迁移率的几大因素1、DNA分子的大小。分子越大，迁移得越慢。2、琼脂糖浓度。给定大小的线性DNA片段在越低浓度琼脂糖的凝胶中迁移率越快。3、DNA的构象。一般超螺旋DNA（I型)>切口环状DNA>线状DNA，但在一些情况下，顺序可能颠倒。所以确定DNA的大小，很多时候要依靠Marker（分子量标记）。4、溴化乙锭（EB）。EB插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。因此线状DNA－染料复合物在凝胶中的迁移率约降低15％。影响迁移率的几大因素5、所用的电压。低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比。电场强度升高时，高分子质量片段的迁移率不成比例的增加。所以当电压增大琼脂糖凝胶所分离的有效范围反而减少。要获得大于2KbDNA片段的良好分辨率，则所用电压不得超过5－8V／cm。6、琼脂糖种类。常见的琼脂糖主要有两种：标准琼脂糖(Agarose)和低熔点琼脂糖（LMPAgarose）。一般低熔点琼脂糖比标准琼脂糖具有更佳的分辨率。琼脂糖品牌的推荐一般来说，琼脂糖的品牌对电泳结果影响不大，但好的琼脂糖做出来的胶韧性比较好，照出来的照片效果好，很清晰，背景很干净。推荐：最好用的琼脂糖品牌：Sigma，日本的一些牌子，强度也很高。性价比比较高的有BioWestAgarose（西班牙品牌），这几乎是目前国内使用最普遍的一种琼脂糖。另外，Promega的Agarose不好用，强度较差。Agarose和Agar的区别注意：Agarose和Agar的区别：琼脂糖（Agarose）是经过挑选，以质地较纯的琼脂（Agar）作为原料而制成的。琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一含有硫酸根和羟基的多糖，它具有离子交换性质，这种性质会给电泳及凝胶过滤以不良的影响。琼脂糖是直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成。琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大（98－99%），近似自由电泳，因为固体支持物的影响少，故电泳速度快，区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很少，是一种较好的电泳材料，分离效果较好。Agarose一般仅用于电泳实验，当然如果不怕浪费的话，也可以用于配固体培养基。效果很好！Agar一般仅用于配固体培养基，绝对不能用于电泳！低熔点琼脂糖的优点标准琼脂糖一般凝结温度在40－42C，熔化温度在85－90度。低熔点琼脂糖一般凝结温度在25－35C，熔化温度在63－65C，甚至更低。一般在30－35C仍呈液态，所以在回收胶内的DNA时，加热溶解胶后不损伤DNA。另外它比标准（普通）琼脂糖有更高的筛分能力。其分辨率接近聚丙烯酰胺凝胶，因此可用于PCR产物、小片段DNA和小RNA（<1kb）的分离。现在它能分辨少至4bp的DNA和分离200－800bp范围内相差2％的DNA片段。但低熔点琼脂糖价格非常昂贵，远高于标准琼脂糖。不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围琼脂糖／％

标准

高强度

低熔点

低黏性低熔点0.30.5700bp-25kb0.8500bp-15kb800bp-10kb800bp-10kb1.0250bp-12kb400bp-8kb400bp-8kb1.2150bp-6kb300bp-7kb300bp-7kb1.580bp-4kb200bp-4kb200bp-4kb2.0100bp-3kb100bp-3KB3.0500bp-1kb500bp-1kb4.0100bp–500bp6.010bp-100bp电泳缓冲液DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子（如用水代替电泳槽及凝胶中的缓冲液）则电导率降至很低，DNA不是不动就是迁移极慢。高离子强度时（如错用了10电泳缓冲液），电导率升高，即使应用适中的电压也会产生大量的热能。最严重时，凝胶会熔化，DNA会变性。常用的两种电泳缓冲液缓冲液

工作液

贮存液／LTAE140mMTris-乙酸盐

501mMEDTA242gTris57.1mL冰乙酸

100mL0.5MEDTA(pH8.0)TBE0.545mMTris-硼酸盐

51mMEDTA54gTris27.5g硼酸

20mL0.5MEDTA(pH8.0)

选择TAE还是TBE？TAE的缓冲容量最低，长时间电泳会被消耗完，应短期更换。TBE成本比TAE稍贵些，但缓冲容量比TAE大得多，可以很长时间不用更换。对于低分子量DNA电泳，TAE分辨率稍低于TBE，而高分子量DNA电泳，TAE的分辨率略高于TBE。因此Southernblot操作中均用TAE作为电泳缓冲液制备凝胶和电泳。超螺旋DNA在TAE中的分辨率要好于TBE。

凝胶载样缓冲液电泳样品上样前需要和载样缓冲液混合。载样缓冲液有三个作用：它增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内；使样品带有颜色便于检查上样过程；其中的染料在电场中可以以预测的速率向阳极迁移。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。在0.5TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝迁移速率约与300bp的线状双链DNA相同，而二甲苯氰FF约与长4000bp的DNA相同。上述关系在浓度范围0.5%-1.4%的琼脂糖凝胶中基本不受浓度变化的影响。用哪种载样缓冲液是个人的习惯。6载样缓冲液缓冲液类型

6缓冲液

贮存温度I

0.25%溴酚蓝4C

0.25％二甲苯氰FF40％（m/V）蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝室温

0.25％二甲苯氰FF15％Ficoll（Type400，Pharmacia）水溶液III

0.25%溴酚蓝4C0.25％二甲苯氰FF30％（V/V）甘油水溶液IV

0.25%溴酚蓝4C40％（m/V）蔗糖水溶液电泳步骤1、用相应的电泳缓冲液加入适量琼脂糖熔化（水浴或微波）配胶，待胶熔化后取一定量（通常20－30mL）加入一个专用的三角瓶中，加入EB使其终浓度为0.5g/ml，混匀后加入一个预先密封好、放好合适的梳子（以形成加样孔）的胶板中灌胶（防止漏胶是要点：用双层胶带纸封胶板或使用现在的防漏胶胶板）。2、让凝胶溶液完全凝胶，一般室温下需要30－45分钟。3、小心拔掉梳子（要点：双手拔），撕去封边胶带，将凝胶安放到电泳槽内。4、向电泳槽内加入电泳液，刚好没过凝胶约1mm。5、混合DNA样品和0.2倍体积6载样缓冲液。（一般在eppendorf管中混匀,要点:快速加样用封口膜加缓冲液）电泳步骤6、用微量移液器及一次性吸头将混合液加入凝胶中的加样孔中，分子量标准应加入加样孔左右两侧的两个孔内。（初学者常常在点样的时候看不清胶上透明的加样孔，一个有效的解决办法是在电泳槽下面垫一张黑色的纸版或塑料膜，这样由于背景是黑色的，很容易发现加样孔。）7、调到合适电压（通常1－5V/cm，实际上有时为了省时间可适当增加电压）电泳。看电极插头有没有插反？阳极和阴极有没有气泡冒出？待溴酚蓝和二甲苯氰FF迁移到适当距离后再停止电泳。（一般等溴酚蓝迁移到胶板的三分之二位置以上即可停止电泳）8、在紫外透射仪下观察凝胶，并用凝胶成像系统照相。电泳过程的动画播放gelelectrophoresis.exe凝胶中DNA定量的方法1、紫外分光光度计法，根据OD260值换算。（定量测定DNA或RNA时需要读取260nm和280nm两个波长下的读数。根据在260nm处的读数可计算出样品中的核酸浓度，1个OD值相当于50µg／mL双链DNA、40µg／mL单链DNA和RNA及33µg／mL单链寡核苷酸。利用260nm和280nm两处读数的比值可估计核酸的纯度。DNA和RNA纯制品的OD260：OD280值分别为1.8和2.0。）必须指出：尽管上述方法测得的DNA浓度一般是很精准的，但有些时候由于仪器或操作的原因，其误差往往远远超过根据肉眼判断的DNA浓度。凝胶中DNA定量的方法2、根据DNAmarker估算。（以DL2000为例）。DL2000由100bp、250bp、500bp，750bp、1000bp、2000bp六条带组成。一般每次取5μl电泳，每条带的DNA量都是相同的，约为50ng，所以5μlDL2000的DNA片段总量约为300ng。如果目标DNA的带与DL2000的某条带差不多大，且亮度相似，则可认为目标DNA的量也为50ng，再除以目标DNA的体积，即为目标DNA的浓度。如果目标DNA的带比markerDNA某条带的亮度高很多倍，可通过系列稀释，使之亮度相似。再考虑稀释倍数计算其浓度；如果目标DNA的带比markerDNA某条带的亮度低很多倍，可通过减少或稀释markerDNA，使之亮度相似。再根据markerDNA的量计算其浓度。3、有些计算机软件可根据上述原理，直接根据所拍凝胶电泳图中marker条带与目标DNA条带大小和亮度的差异，直接计算出目标DNA的浓度。两种核酸染色方法溴化乙锭（EB）染色法：灵敏度：10ngDNA条带。配制：通常用水将溴化乙锭配制成10mg/mL的贮存液，于室温（或4C）保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中。电泳时的工作浓度是0.5g/ml，大多数情况下可以预先加入胶中。但当需要知道DNA片段的准确大小（如DNA限制酶切图谱的鉴定时片段大小很接近）时，凝胶应该在无EB条件下电泳。电泳结束后用EB染色。染色时，将凝胶浸入含有EB0.5g/ml）的电泳缓冲液中，室温下染色30－45min。染色完毕后，通常不需要脱色。但在检测小量DNA（<10ng）片段时，通常要将染色后的凝胶浸入水中或1mMMgSO4中,室温脱色20分钟更容易观察到。废弃溴化乙锭EB净化和处理方法1、严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害很大。2、

废EB溶液的处理方法：

(1)

对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理：

a.

将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml；

b.

加入一倍体积的0.5mol/L

KMnO4

，混匀，再加入等量的2.5mol/L

HCl，混匀，置室温数小时；

c.

加入一倍体积的2.5mol/L

NaOH，混匀并废弃。

(2)

EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理：

a.

按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时；

b.

用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。3废EB接触物，如抹布，枪头。一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期进行焚烧处理。凝胶SYBRGold染色法SYBRGold是一种新型的极敏感的染料的商品名称。它激发的荧光信号（300nm透射光下激发出亮黄色荧光）的强度是EB－DNA复合物的1000多倍，因此用SYBR－Gold可检测出琼脂糖凝胶中小于20pg的双链DNA，少至100pg的单链DNA或300pg的RNA。SYBRGold以10000x的浓度贮存在无水的DMSO（二甲基亚砜）中，其昂贵的价格使其不适合用于常规凝胶染色。但是将该染料在某些实验中（单链构象的多态性和变性梯度凝胶电泳）替代放射标记DNA是物有所值的。使用时，DNA片段经过凝胶电泳分离后，用SYBRGold贮存液的稀释液（1：10000）浸染凝胶。不能将SYBRGod加入熔化的凝胶中或电泳前加入凝胶，这是由于在SYBRGold存在的情况下，凝胶中核酸的电泳条带会发生严重变形。另外由于SYBRGold对荧光敏感，所以其工作液应该当天用电泳缓冲液新鲜配制，室温存放。

电泳的主要用处1、质粒或基因酶切图谱的鉴定。2、核酸或蛋白质大小的检测。3、DNA酶切片段或蛋白质的纯化和回收。核酸回收的几种经典方法1、低熔点琼脂糖凝胶中有机试剂抽提。2、用玻璃珠从琼脂糖凝胶中回收DNA。3、琼脂糖酶消化法。4、凝胶切槽法。5、冻融法。6、Kit法。1、低熔点琼脂糖凝胶中有机试剂抽提由于低熔点琼脂糖在37C仍保持液态，一些酶学反应操作如连接、合成放射性探针以及限制性酶切等反应，均可通过将含有目的DNA片段的凝胶直接加入到反应体系中来完成。然而总体上讲，DNA聚合酶、连接酶以及限制酶在液胶状态下比在常规的缓冲液中工作效率要低，一般不建议这么做，所以很多实验要从凝胶中回收DNA片段后再进行下面的实验。步骤：1、利用低熔点琼脂糖制备胶块，电泳，使目的片段与其它条带完全分开。在紫外灯下，用一锋利的刀片切下含有目的条带的低熔点琼脂糖凝胶切片，转移到一个干净的一次性使用的塑料管中（尽量将多余的凝胶切掉，以减少抑制剂对DNA的污染量）。（要点：节省低熔点凝胶的方法）2、加5倍体积的LMT洗脱缓冲液[20mMTris.Cl(pH8.0),1mMEDTA(pH8.0)]至琼脂糖切片中。盖好管盖，于65C温育5分钟熔化凝胶。3、待凝胶冷却至室温后，加等体积的Tris平衡酚，将混合液混旋20S。在20C以4000g离心10分钟，回收水相（界面的白色物质是琼脂糖）。4、再用等体积的酚：氯仿、氯仿各抽提一次。5、水相转移到另一新的离心管中。加0.2倍体积的10M乙酸铵和2倍体积4C的无水乙醇。混合液在室温下放置10分钟。然后4C，5000g(SorvallSS-34转子相当于6500r/min)离心20min，沉淀回收DNA。6、用70％的乙醇洗涤沉淀，并溶于适当体积的TE（pH8.0）中。低熔点琼脂糖凝胶中回收纯化的DNA适于分子克隆中的大多数酶学操作，但对于一些要求更严格的实验，如转染、显微注射等需要高纯度的DNA，此时需要用商品化的各种树脂进行纯化。节省低熔点凝胶的方法用普通Agarose配制胶块进行电泳，待各DNA条带在胶上完全分开后，关掉电泳仪，取出胶板，在紧靠目的条带正前方的泳道上用刀片挖一个长方形的小槽，注意要将胶块的底物挖通，然后用低熔点琼脂糖和电泳缓冲液配制少量胶块，融化后，趁热倒入所挖的长方形小槽内，室温放置数分钟，使其完全凝固。然后将补好的胶块重新放入电泳槽中进入电泳。同时用手提式紫外灯实时监控目的条带，直至目的条带完全进入挖好的槽中。停止电泳，将低熔点琼脂糖胶块中含有目的DNA的条带切下，即可进行后续操作。2、用玻璃珠从琼脂糖凝胶中回收DNA原理：在高盐状态下，可使呈液态的低熔点琼脂糖切片中的DNA结合到玻璃珠（粉）上。洗涤液清洗后，利用低盐缓冲液洗脱结合到玻璃珠上的DNA，从而可以有效回收DNA。优点：比有机试剂抽提法更快速，纯度更高；缺点：回收产量往往较低。步骤：1、将切好的凝胶切片转移到一聚丙烯管中。2、加3－5倍体积的碘酸钠溶液，55C温育5分钟熔化凝胶。当凝胶完全熔化后，不宜再进行加热。3、对于5g的DNA样品，加入5l玻璃珠。对于>5g的DNA样品，每增加1g的DNA需额外增加2l玻璃珠。室温温育5min,并不时摇动。4、微量离心机以最大转速离心5s,弃上清。5、用500l洗涤液[20mMTris.Cl(pH7.4),1mMEDTA,100mMNaCl,加等体积的乙醇，0C可保存3－4个月。]连洗沉淀3次，以0.5gDNA/l重悬于TE（pH8.0）。6、45C温育DNA／玻璃珠混合物3ml,使DNA从玻璃珠上洗脱。7、微量离心机以最大转速离心1min,将含DNA的上清移至另一新的离心管中，4C（或－20C）保存。3、琼脂糖酶消化法

原理：琼脂糖酶使琼脂糖多聚体水解成双糖。这样获得的DNA再经酚抽提、乙醇沉淀进行纯化。由于该法较为温和，因此特别适用于从脉冲场琼脂糖凝胶中回收高分子量的DNA，从恒强电场琼脂糖凝胶中回收小分子DNA也同样有效。1、将切好的凝胶切片转移至微量离心管中，加入20倍体积（1微克加入20微升）的凝胶平衡缓冲液［10mMBisTris-Cl(pH6.5)］,5mMEDTA(pH8.0),0.1MNaCl],室温静置30min。2、将凝胶切片转移至另一加有等体积凝胶平衡缓冲液的新微量离心管中。3、65C温育10min，使凝胶切片熔化。冷却至40C，加入无DNA酶的琼脂糖酶，每200l凝胶加入1－2单位。40C温育1h。4、此时的DNA溶液可直接用于连接、酶切及转化等实验。此外，如果需要，DNA溶液还可作进一步的纯化和浓缩。纯化小片段DNA（<20kb）A.用平衡酚抽取DNA溶液两次。B.将水相转移至一新管中，加入两倍体积的TE（pH8.0），这一步操作有助于防止寡糖沉淀。C.加入0.05倍体积的5MNaCl，随后加入2倍体积的乙醇（指上步中的DNA终体积）l。置0C预冷15分钟，微量离心机4C以最大转速离心15分钟收集沉淀。D.小心地吸出乙醇，加入0.5ml处于室温的70％乙醇。混合均匀，按步骤C所述离心。E.吸去上清，打开离心管。置于操作台上数分钟，挥发去除残留乙醇，将DNA溶于适当体积的TE（pH8.0）中。纯化大片段（>20kb）A.将琼脂糖酶消化过的样品移至一透析袋中，扎好或封好后将透析袋放在含100mlTE(pH8.0)的烧杯或三角瓶中。B.4C透析样品数小时。为防止大片段DNA的断裂损伤，应尽可能避免酚抽提、涡旋以及乙醇沉淀。在透析缓冲液中加入30M的精胺和70M的亚精胺可提高大分子DNA的回收效率。4、凝胶切槽法1、待各DNA条带在胶上完全分开后，关掉电泳仪，取出胶板，在紧靠目的条带正前方的泳道上用刀片挖一个长方形的小槽，注意切勿将槽的底部挖开，底部应保留一薄层胶。2、将电泳槽中的缓冲液倒掉（吸取）一些，使得缓冲液不要没过胶表面。将胶板重新放入电泳，在挖好的槽中加满15％PEG4000溶液（以电泳缓冲液配制），用手提式紫外灯实时监控目的条带，直至目的条带完全进入挖好的槽中。3、关闭电泳仪，用移液器小心将胶槽里的含目的DNA片段的PEG溶液吸出，加入一个新的离心管中。4、酚：氯仿抽提1－2次。5、无水乙醇沉淀和70％乙醇洗涤步骤同方法1（有机试剂抽提）中的步骤。优点：不需LMTAgarose，步骤少，