微生物学：15四体+真菌

螺旋体的检验

P237

重庆医科大学Lunan

一、概述

螺旋体（Spirochete）是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状，运动活泼的原核细胞型微生物。

生物学性状介于细菌与原虫之间。

似细菌：有CW，原始核，二分裂方式繁殖，对抗生素敏感，可人工培养。

似原虫：运动有赖于菌体内鞭毛的屈曲与收缩。所致疾病能周期性再发。

第一节分类分子生物分类的发展2004年《伯杰细菌分类手册》将螺旋体分为1目3科13属

螺旋体广泛存在自然界和动物体内，种类多，

致病性螺旋体主要有下述3个属：

疏螺旋体属（Borrelia）密螺旋体属（Treponema）钩端螺旋体属（leptospira）

问号状钩端S→野鼠、猪（储存宿主）→肾→尿→水→疫水→接触易感者的破损皮肤粘膜→钩体病，国内以该种S为主。双曲钩端S→接触感染者的破损皮肤粘膜→一般不致病

第二节钩端S属（Leptospira）一、临床意义

钩体病是一种典型的人兽共患病；全世界至少已发现200多种动物为问号状钩体的携带者。钩体病遍布世界各地，我国也是一个常见病和多发病，秋收季节（打谷时）高发，故又名打谷黄。早期临床症状为：寒热、酸痛、一身Pa、眼红、腿痛、淋巴大（有差异）。

其他症状：P238二、钩端螺旋体的检验

钩端S型别多，型与型之间无交叉免疫，应用暗视野显微镜凝集溶解试验（MAT）和凝集吸收试验（AAT）可将钩端S属进行血清群和血清型分类。

目前把问号状钩体至少分为25个血清群，273个血清型，我国使用的问号状钩体参考菌株有15群15型，其中大多数为我国流行的群或型，参见表16-2。

（一）检验程序(图16-2)

直接镜检，分离培养，动物实验

（二）标本采集

发病第一周内采血液1-2ml。

发病第二周开始采尿（30-50ml）和脑脊液（0.5-1.0ml）。

测Ab采双份血清（6-10天，3-4周各采一次）

尸检时采肝、肾、脑、肺等脏器。

（三）标本直接镜检

1、直接显微镜观察

①标本→差速离心→沉淀→1滴+盖破片→暗野观察

②标本→镀银染色（S+AgNO3+甲醛）→普通显微镜观察：S呈棕色

③标本→直接免疫荧光法→荧光显微镜观察

2、核酸检测DNA探针检测标本中钩体核酸可检出含有200条钩体的标本。加用PCR技术扩增钩体特异DNA片段：23sDNA，可检测出全血、血清、脑脊液、尿液可检出10条钩体；引物序列：P241；（四）分离培养

标本（血，尿）→柯氏（Korthof）培养基（28~30℃1周）→云雾状混浊→暗野显微镜观察→有钩体存在→已知诊断的血清→鉴定其血清群和型。若无钩体存在→继续培养30天，仍无钩体生长→则判为阴性。

目的意义：

（1）可确诊病人。

（2）查明钩体菌型的分布状态，疫源地存在的特点和研制相应的疫苗，进而为防控钩体病的流行提供可靠资料。

（3）充实国家标准菌株。

（五）抗体检测

采取疑似病人发病初期和3-4周的双份血清或脑脊液，56℃30min灭活。

1、显微镜凝集溶解试验：测疑似钩体病人双份血清中的Ab效价，一般效价>1：300有诊断意义，或双份血清效价增高4倍以上，则可确诊本病。

原理：钩体病人血清中同时存在凝集素和溶解素，故在凝集反应的同时往往伴有溶解现象。

用途：因本试验具有高度型的特异性，故可用已知Ag测未知Ab，也可用已知Ab来鉴定未知Ag，从而协助钩体病的诊断或分型。

方法：

（1）用PBS倍比稀释患者血清（0.1ml/管）：

1：50、1：100、1：200……1：1600

（2）加入等量活钩体Ag(0.1ml/管)：

轻摇混均，28~30℃2小时。

（3）于暗视显微镜下判钩体的效价

“1+”25%的菌体凝集

“2+”50%以上菌体凝集或溶解

“3+”75%以上菌体凝集或溶解

“4+”近100%菌体凝集或溶解

“—”全部菌体正常，与盐水对照相同。

结果：Ab效价>1：300或双份血清Ab效价相差4倍以上为阳性。

2、间接凝集试验

钩体属特异Ag→载体（乳胶颗粒、活性碳、干血细胞）→（致敏颗粒）+病人血清（Ab）→载体的间接凝集。

3、ELISA

用ELISA法和IgM-斑点-ELISA法可间接检测钩体病人血清中特异Ab，可用于钩体病的快速诊断。被检血清须经56℃30min灭活，当OD值为阴性对照血清OD值的2倍时为阳性。也可用肉眼直接观察结果。

（六）动物试验

幼龄豚鼠或金地鼠对钩体敏感，称为钩体的“生物滤器”，故可用来检查疫水或有杂菌污染的标本。但费用高，操作复杂。

防治措施：“三早一就”。防鼠灭鼠，保护水源，接种疫苗等。

伯氏S→硬蜱（媒介）→莱姆病（lymedisease）：游走性红斑，圆形皮损，发热，头痛。

第三节疏S属（Borrelia）：莱姆病检验螺旋稀疏且两端稍尖；周浆鞭毛有2~100根以上，与运动有关；Giemsa染色为淡紫色，镀银染色为棕褐色；营养要求高，微需氧，5%~10%CO2促进生长，常用BSK培养基（长链饱和与不饱和脂肪酸，氨基酸和牛血清蛋白及灭活兔血清等），生长缓慢；奋森S→梭b协同→机体免疫力下降→奋森咽峡炎、牙龈炎、口颊坏疽、溃疡性口腔炎。回归热流行性回归热(虱传回归热)地方性回归热(蜱传回归热)反复发热缓解3-10次苍白(梅毒)亚种→性传播→梅毒(STD)

地方亚种→粘膜损伤→地方性梅毒

极细(雅司)亚种→接触皮损→雅司病第四节密S属（Treponema）品他S→皮损→品他病苍白S：分三个亚种梅毒（syphilis）

只感染人类：性病梅毒，先天梅毒，输血后梅毒。性病性梅毒按照病程分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期早期

Ⅰ期梅毒：传染性极强，无痛性硬下疳。一年

Ⅱ期梅毒：梅毒疹，淋巴结肿大。十年

Ⅲ期梅毒：传染性小但破坏性大，神经梅毒，心血管梅毒，梅毒瘤最常见。基本病变是慢性肉芽肿。梅毒螺旋体的检验

（一）标本的采集

下疳分泌物，皮疹渗出液，组织块→组织悬液，血清或血浆（4℃或-20℃送检）。

（二）检验程序：图16-6

（三）检验方法

1、直接镜检

标本→玻片→暗视野显微镜→有幼小的密螺旋体，有诊断意义。也可用镀银法或直接荧光检测法。

免疫荧光染色镀银染色2、分离培养

棉尾兔上皮细胞在1.5%O2、5%CO2、93.5%N233℃条件下经9-12天获培养成功，并保持毒力，但条件高，仅适用实验室研究。必要时可作兔睾丸接种保存菌种，但毒力消失。

3、PCR

多个靶基因，常规用PCR，巢氏PCR，荧光PCR。诊断血清学阴性的早期梅毒和神经梅毒，以及区分胎传梅毒和母体梅毒有意义。

4、血清学试验

由于潜伏期和晚期梅毒不出现皮肤粘膜病损，得不到直接检出的标本，加之梅毒螺旋体不能在体外迅速分离和生长，所以血清学试验非常重要。有两个试验类型的试验：

(1)非密螺旋体Ag：用牛心肌的心脂质作为Ag测病人血清中的反应素（抗脂质Ab），阳性率高，有诊断价值，常用有2种试验（VDRL、RPR）。

(2)密螺旋体Ag试验：用密螺旋体Ag检测病人血清中特异Ab，有5种试验（FTA-ABS、FTA-ABSDS、MHA-TP、ELISA和IBT），由于梅毒螺旋体和雅司螺旋体Ag相似，故血清学试验不能区别这些密螺旋体所致疾病。此外自身免疫性疾病有时也可以出现假阳性。

上述血清学试验的选择原则：

WHO初筛试验：VDRL、RPR，

确认试验：FTA-ABS、FTA-ABS-DS、

MHA-TP、ELISA和IBT。

对疑为先天性梅毒者：

可用RPR半定量试验每月检测一次，连续6个月，检测反应素效价。或用VDRL定量试验检测Ab效价的变化。如Ab效价增高或稳定在高水平，表明是先天梅毒，如Ab是来自母体IgG，通常2-3月内消失。

瓦氏反应,Wassermannreaction利用抗原抗体复合物同补体结合，把含有已知浓度的补体反应液中的补体消耗掉使浓度减低的现象，以检出抗原或抗体的试验，为高敏度检出方法之一，特别是根据抗原物质的特性，抗原抗体反应不能用沉淀反应或凝集反应观察时也可以利用此法；绵羊红细胞+抗体溶血反应，检测还有多少补体存在；思考题：

1、何谓显微镜凝集溶解试验（概念、原理、用途、方法）？

2、某地秋收季节疑有钩体病流行，你应如何确诊病人？并采取哪些防治措施？

3、简述梅毒病的微生物学检验。

支原体的检验

一、概念

支原体（Mycoplasma）是一类缺乏细胞壁、呈高度多形性，能通过除菌滤器，在无生命的培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物。（能形成有分支的长丝）

缺乏CW，呈多形性（球状、丝状、酒瓶状）d=0.2μm±，能通过细菌滤器，能在无生命的人工培养基中繁殖（二分裂法，分枝出芽……）。菌落为“油煎蛋”状。含DNA和RNA两种遗传物质。

其大小似病毒，生活方式似细菌，它是一类微小的原核M。

生物学特征

支原体与L型细菌的区别1、在遗传上与细菌无关2、CM含高浓度胆固醇3、大多需高渗培养基支原体L型细菌1、与原菌相关，常可以恢复2、CM不含胆固醇3、在一般培养基稳定4、生长慢，菌落小，d0.1-0.3mm4、菌落稍大，d0.5-1.0mm5、液体培养混浊度低5、液体培养有一定混浊度，可粘附于管壁或管底二、主要致病支原体肺炎支原体溶脲脲原体人型支原体生殖器支原体穿通支原体1、肺炎支原体——肺炎，支气管炎，肺外并发症（脑膜炎、心肌炎、心包炎、肾炎等）。儿童青少年居多，秋冬多发。婴儿有间质性肺炎时应考虑。

2、溶脲脲原体——非淋菌性尿道炎（NGU）、不育症、慢性前列腺炎、流产、不孕症、新生儿低体重等症。

3、生殖器支原体——可能与持续性、复发性非淋菌性尿道炎、V急性盆腔炎、阴道炎、慢性前列腺炎（泌尿生殖道感染）。

4、穿通支原体——多见于艾滋病（是加速AIDS进程的一个协同因子）

5、人型支原体——非淋菌性尿道炎、慢性前列腺炎、宫颈炎与盆腔炎。（泌尿生殖道感染）。

三、M检验

采取合格标本：病人痰、咽拭子、鼻咽洗液、支气管分泌物、胸水；（肺炎支原体）

尿液（晨尿中段）、泌尿道分泌物、前列腺分泌物、阴道分泌物、宫颈分泌物等（脲原体）

检验程序见图17-3P256

1、直接镜检：EM下可发现d200nm大小有三层细胞膜的Giemsa染色呈淡紫色颗粒。没有细胞壁。2、分离培养（营养要求相似细菌）：Hayflick培养基：牛心消化液+20%小牛血清+新鲜酵母浸膏+抑菌物+醋酸铊+CO2，pH7.6-8.0，37℃1-4周方长出油煎蛋样菌落（LP或HP），阳性率仅64%。

肺炎支原体“油煎蛋”菌落(10×)3、鉴定本培养和检测根据肺炎支原体在宿主细胞内代谢累积分解葡萄糖，通过化学显色的方法在较短的时间内快速检测出肺炎支原体。支原体之间的鉴别（图17-1）。

支原体葡萄糖精氨酸尿素吸附细胞致病性肺炎支原体+--红细胞肺炎、支气管炎泌尿生殖道感染泌尿生殖道感染人型支原体-+--生殖器支原体+---穿通支原体++-红细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞条件感染、多见于艾滋病溶脲脲原体--+-泌尿生殖道感染4、PCR：查肺炎支原体的DNA，快速敏感、特异、防感染。（敏感。避免污染）

5、抗体检测：ELISA（可靠，特异性和敏感性高）；冷凝集试验（4℃凝集，37摄氏度散开）；补体结合试验；间接血凝试验（肺支和生殖道支有交叉反应）。

冷凝集试验

肺炎支原体引起的肺炎患者血清中常产生冷凝集素（非特异性自身Ab，IgM），它与2%O型人或自身的RBC，在4℃过夜，出现RBC凝集现象，效价>1：64（常规法），50%的病人发病1-2周后呈阳性反应，是一种非特性血清学反应。

呼吸道合胞V、腮腺炎V、流感V等感染后也可出现血中冷凝集素效价升高。

解脲脲原体

（Ureaplasmaurealyticum，Uu

）也称“溶脲脲原体”。是人类泌尿生殖道最常见的寄生菌。与性接触的多少和有无有关。液体培养基阳性可初步报告。检验程序（图17-5）培养结果相应固体培养基后，培养基中硫酸镁与氨反应，氢氧化镁黑色沉淀—黑色菌落阳性阴性衣原体的检验（Chlamydia）

一、概念

衣原体（Chlamydia）是一类专性细胞内寄生，有独特发育周期，能通过细菌滤器的原核细胞型微生物。

似细菌：

有两种遗传物质（DNA+RNA），有核糖体和复杂的酶系统，有CW，二分裂法繁殖，对抗生素敏感。

似病毒：

体积微小，能通过细菌滤器，活C内寄生。

二、致病情况

沙眼CH→沙眼，是致盲的主要原因。尚可引起包涵体结膜炎，数周或数月可痊愈。

淋巴肉芽肿CH→淋巴肉芽肿。

上述两种CH是致严重的性传播疾病之病原，引起泌尿生殖道感染。

鹦鹉热CH→肺炎

肺炎CH→肺炎。

三、微生物学检验

疑为CH感染的患者，要确定诊断必须对患者进行CH的检验。操作的实验室必须注意安全，以防环境污染和实验室感染，尤其是操作鹦鹉热的实验室，应严格按强毒株实验室管理条例修建和操作。

（一）直接镜检：

1、找包涵体：疑为沙眼CH感染，应取眼穹窿及眼结合膜或宫颈（上皮或分泌物）刮片，经干燥固定后姬姆萨染色，查包涵体，只要查见有包涵体(密度较低，疏松，呈空泡型，内含糖原，碘液染色呈阳性)则有诊断价值，此法简便、快速，但敏感性差，阳性率仅为30-40%。

2、IF检查Ag：用直接荧光Ab法检测上皮细胞内典型CH-Ag

（二）酶免疫检测：检测标本中可溶性Ag

（三）胶体金法检测衣原体（常用）

（四）核酸检测：

DNA探针杂交：敏感，特异，快速，仅1h。

PCR技术：敏感、特异、快速、仅4-5h

（五）分离培养与鉴定

采取适当标本→处理→分离培养：

细胞培养:（最可靠的方法）

沙眼CH、淋巴肉芽肿CH→McCoy、Hela-229。

尚可用HEP-2和H-292分离培养肺炎CH。

鸡胚卵黄囊：沙眼CH（汤飞凡.1956）

小白鼠：鹦鹉热CH→腹腔、滴鼻。

鉴定试验：

Giemsa染色→暗野镜检：沙眼CH成熟包涵体(主要为原体，嗜酸性)呈紫红色，而其幼稚型包涵体(主要含始体，嗜碱性)呈暗蓝色，且均位于上皮细胞胞质内。（图18-2）

Lugol碘液染色→HP→在黄色背景上见到红褐色胞质内包涵体，可作为鉴别沙眼CH与其他CH(不含糖原)的参考。

IF-Ab染色法：为特异血清学鉴定。可鉴定CH的型别；

抗外膜蛋白(MOMP)单克隆抗体鉴别生殖道标本培养物的沙眼CH。

抗LPS单抗用于鉴别呼吸道标本培养物的鹦鹉热CH和肺炎CH。

（五）抗体检测：

可用补体结合试验（CF），微量免疫荧光测验(MIF），酶免疫法等测Ab，但在临床诊断中价值不大。不易获得衣原体感染者急性期、恢复期双份血清，另性传播疾病的高危人群原有Ab水平较高，因限制了血清学诊断CH感染的价值。

立克次体的检验

一、概念

（Rickettsia）天然寄生于节肢动物体内（虱、蚤、蜱、螨），并以节肢动物为传播媒介进行传播的一类G-小杆状或球杆状的专性寄生于宿主细胞内繁殖的原核细胞微生物。

为了纪念因研究斑疹伤寒不幸感染而献身的US青年医生Ricketts，为纪念他的贡献，便以他的名字而命名此类微生物。

立克次体的共同特点是：

1.大小介于细菌与病毒之间；

2.有细胞壁，但形态多样；

3.绝大多数为专性细胞内寄生；

4.含有DNA和RNA两种核酸，以二分裂方式繁殖；

5.大多是人畜共患病原体，引起人类发热出疹性疾病；

6.以节肢动物为传播媒介或为储存宿主；

7.对四环素、氯霉素等抗菌药物敏感。

二、致病情况

1、普氏R→人虱→流行性斑疹伤寒，在世界各地流行。

2、莫氏R→鼠蚤→地方性斑疹伤寒，在世界各地流行。

3、恙虫病R→恙螨→恙虫热病，在台湾、福建、两广、浙江、江苏、东南亚、日本、有报导。

4、贝纳柯克斯体(Q热R)→蜱→Q热，在世界各地流行

5、埃立克体→蜱→埃立克体病

6、汉赛巴通体→接触猫→猫抓病、杆菌性血管瘤-杆菌性紫殿（HIV，tumor，organtransplantation）……共20余种

三、M检验

R的实验室诊断是确诊R感染和进行流行病学调查的重要措施。R的传染性强，必须注意实验室的安全与防护，实验室工作者应事先接种疫苗，必要时应进行药物预防。

（一）采取合格标本（血液，活检或尸检标本）→适当处理

（二）标本直接检测：

1.免疫荧光检测:脏器印片、切片，检测Ag；

2.核酸检测:PCR敏感性高。

（三）分离培养：GP腹腔接种：发热、阴囊肿胀；鸡胚卵黄囊接种:收获卵黄囊；细胞培养：HeLa、Vero…。

（四）血清学诊断（双份血清，测Ab效价，或用已知Ab，鉴定未知Ag）：

IFA（间接免疫荧光）、ELISA、CF（补结）、MA（微量凝集）、IHA（间接血凝）、LA（乳胶凝集）和外斐试验（Weil-Felixreaction）。

外斐试验：

因为绝大部分R（Q热等除外）与某些变形杆菌（OX19、OX2、OXk）有共同的耐热性多糖类属Ag，所以利用变形杆菌这些菌株代替R作为Ag，检测疑为R患者血清中相应的Ab的一种非特异性交叉凝集反应。用以协助R病的诊断，一般效价>1：160为阳性，若在病程中有4倍增长更有诊断价值。

特点：Ag易得，方法简便；但缺乏敏感性与特异性。有试管法和玻片法两种。

思考题：

1、简述支原体、衣原体、立克次体的概念和基本检验技术。

2、为什么衣原体、立克次体和支原体是介于细菌和V之间的M？它们可分别引起哪些疾病？

3、试比较L型菌和支原体有何异同？

4、名词解释：

外斐试验、冷凝集试验

真菌的检验

一、概述

真菌（Fungus）为不分根、茎、叶和不含叶绿素的一大类真核细胞微生物。

真菌分布广，种类多。目前公认的有8000个属，100万个种。

大多真菌对人类是有益的，其中有些真菌为人类创造了巨大的物质财富：如食用菌（香菇、木耳、银耳）、药用真菌（神曲、茯苓、灵芝、麦角等）、工业真菌（制酱、酿醋、酿酒、制革、生产抗生素等）、农业真菌（9.20生长制激素、醣化饲料、微生物饲料添加剂等）。

但有少数真菌（400种）可引起人致病，叫病原性真菌。

按其侵犯部位不同，病原性真菌可分为浅部感染真菌（表面真菌、皮肤癣真菌和皮下组织感染真菌）和深部感染真菌（假丝酵母菌、隐球菌、曲霉、毛菌目真菌、组织胞浆菌和卡氏肺孢菌）。

近年来由于抗生素、免疫抑制剂和放射疗法等在临床广泛应用，招致菌群失调和机体免疫因素降低，引起真菌二重感染与日俱增，应引起医务工作者的高度重视。另有大量文献报告黄曲霉素可导致肝脏变性、肝细胞坏死、肝硬化，也可诱发家兔、GP等动物的实验性肝癌，可能与人的肝癌相关。

镰刀菌——胃癌，胰腺癌，垂体和脑肿瘤。

青霉菌——甲状腺瘤，肝脏肿瘤。

展青霉素——肉瘤。临床上疑为真菌病的患者要明确诊断，必须进行真菌的检验。

一、正确采集与处理标本

根据真菌感染的部位采集不同的标本，要求保质、保量、保鲜和无污染。

原则：早期采集；无菌采集；根据目的菌的特征性用不同的方法采集；采集适量标本；安全采集。1、痰：采晨痰，采前清洁口腔、深咳取痰5-10

ml于灭菌容器中，2h内送至实验室，若>2h则需加入抗生素（“氯”0.05mg/ml或“青”20u/ml，“链”40u/ml）于4℃中冷藏，注意无菌操作，有条件者应取支气管冲洗液。若痰液粘稠，则用N-乙酰半胱氨酸或二硫丙醇稀释，再取0.5ml接种于培养基。

2、脑脊液、尿液、脓汁：应在无菌条件下穿刺取材，2000rpm15min离心，取沉淀物涂片镜检，并取0.1ml沉淀物接种适当培养基。

3、血液：无菌条件下取抗凝血，置于适当培养基中30℃有O2培养，每周检查一次，并取培养物于肉汤中培养，连续观察6周。

4、皮屑：清洁皮肤，用75%酒精消毒局部皮肤，用无菌水擦去酒精，再取标本。

5、毛发：取病发15根、消毒。3-5根直接镜检

，5-10根接种于SDA斜面。

6、甲屑：钻取交界处组织培养。

7、活检标本：取2份，一份镜检培养，另一份送病理检验。二、直接镜检

标本→制片（标本+10%KOH，加盖玻片，并微加热）→镜检（LPorHP）：菌丝、孢子。

该法可直接快速准确地确定有无真菌感染，但阴性结果也不能完全除外真菌感染。

三、分离培养

可确定真菌的菌种，弥补直接镜检之不足。

培养基：常用沙氏培养基

培养条件：

浅部真菌常用22～28℃（平均25℃），需O2、潮湿、PH5.5，生长缓慢、1-2W才长出菌落。

深部真菌条件似普通细菌，35℃～37℃，3-4天可见菌落。

培养方法：

1、大培养：标本→沙氏斜面→菌落形态：酵母型(如酵母菌、新生隐球菌)；类酵母型(如白色假丝酵母)；丝状型(皮肤丝状菌…)。

2、小培养

标本→玻片培养基+盖玻片→直接镜检菌丝、孢子

注意真菌的临床标本检验主要依靠直接镜检及分离培养技术，只要在临床标本中连续3次检出同种形态的菌丝和孢子及某种特殊结构，则可认为所查真菌为致病性真菌。

四、动物接种

是研究真菌的重要方法之一。

动物实验目的：

1、分离病原性真菌。

2、确定菌种的致病性；

3、观察真菌在组织内的形态及组织学变化；

4、可恢复和加强菌种的毒力；

5、用于真菌的基础研究。

如新生隐球菌—小白鼠敏感，腹腔或颅内注射，小白鼠很快发病，并可于腹腔或颅组织中找到本菌。

又如白色假丝酵母—家兔感染最敏感和强烈，用1ml1%NS菌悬液静脉注射，4-5天内可死亡，肾脏可见小脓肿，镜检可见2.5-4.0µm的芽生细胞。

再如皮肤丝状菌悬液外涂于GP或家兔的皮肤，可引起皮肤感染。

五、病理组织检验

是诊断真菌病，特别是深部真菌及鉴定双相真菌（在动物体内和37℃含动物蛋白的培基内呈酵母型，在22℃沙氏培养基上出现丝状型菌落）的重要方法。真菌引起的病理变化为非特异性，但