微生物耐药基础与临床之细菌耐药

1(/chenamos/Pseudomonas)细菌耐药挑战人类智慧2提要抗菌药物与细菌的博弈细菌耐药机制33状新病原体不断出现、已控制的病原体死灰复燃

感染因子在非感染性疾病中的作用明显易感人群的不断增加医院感染日趋严重细菌耐药日趋严重感染病的现状与未来

44易感人群增加、医院感染严重随着医学的发展，医疗活动中侵入性操作越来越多；为治疗需要，激素或免疫抑制剂的大量使用。住院病人中慢性疾病、恶性疾病、老年病人比例高。医务人员对医院感染及其危害性认识不足。广泛使用抗生素，造成人体正常菌群紊乱，引起条件致病菌感染。病人出院后可将院内感染的病原体，特别是耐药菌带到家庭和社会，引起传播和流行。

耐药菌增加，治疗困难！56人类智慧挑战病原菌

细菌耐药挑战人类智慧抗菌药物与细菌的博弈71928年，细菌学家弗莱明发现第一个抗菌药物，

青霉素。81942年，青霉素首次用于救治战伤患者，拯救了许多人的生命。1945年，“发现青霉素及其临床效用”分享诺贝尔生理学奖。弗洛里

Florey弗莱明Fleming钱恩Chain9DiscoveryofAntibacterialAgentsCycloserineErythromycinEthionamideIsoniazidMetronidazolePyrazinamideRifamycinTrimethoprimVancomycinVirginiamycinImipenem19301940

195019601970198019902000PenicillinProntosilCephalosporinCEthambutolFusidicacidMupirocinNalidixicacidOxazolidinonesCecropinFluoroquinolonesNeweraminoglycosidesSemi-synthetic

penicillins&cephalosporinsNewercarbapenemsTrinemsSyntheticapproachesEmpiric

screeningNewermacrolides&ketolidesRifampicinRifapentineSemi-syntheticglycopeptidesSemi-syntheticstreptograminsNeomycinPolymixinStreptomycinThiacetazoneChlortetracyclineGlycylcyclinesMinocyclineChloramphenicol1010“Closethebookoninfectiousdisease”“Infectiousdiseasewillbewithusfortheforeseeablefuture”1111伴随着抗菌药物的使用，

细菌耐药问题接踵而至。1942年报道金葡菌对青霉素耐药。20世纪40年代耐药率仅为1%，20世纪末超过了90%。1961年甲氧西林（methicillin）问世，1965即报告出现耐甲氧西林金葡菌（MRSA）。后来研发的万古霉素对MRSA一直相当敏感，但在20世纪90年代末期，又有金葡菌对万古霉素敏感性降低的报告，2002年以来先后报道对万古霉素完全耐药的金葡菌。1213伴随着抗菌药物的使用，

细菌耐药接踵而至。14肺炎克雷伯菌NDM-1病菌在全球大规模蔓延的潜在危险“明确而令人恐惧”。1516多重耐药（multipledrugresistance,MDR)

对下列5类抗生素中的3类及3类以上耐药。泛耐药（pan-drugresistance.PDR)

对下列5类抗生素都耐药。1、抗假单胞菌的头孢菌素类2、碳青酶烯类3、β-内酰胺酶复合制剂4、喹诺酮类5、氨基糖苷类17

耐药菌的精锐部队ESKAPE“逃跑”Enterococcus

肠球菌（

VRE）Staphylococcus

金黄色葡萄球菌（MRSA）Klebsiella

肺炎克雷伯菌Ainetobacter

鲍曼不动杆菌Pseudomonasaeruginosa

铜绿假单胞菌Enterobacterspecies

肠杆菌碳青霉烯耐药1818耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

（methicillinresistantStaphylococcusaureus，MRSA）美国弗吉尼亚州一名17岁高中生阿什顿·邦兹，2007年10月4日感到身体一侧疼痛，到当地一家医院就诊。10月17日死亡。因感染MRSA。21所学校停课。MRSA传染在美国每年造成9万人严重感染，因此致死的人数甚至超过艾滋病。

ZellerJL,etal.MRSAinfections.JAMApatientpage.2007Oct17;298(15):1826.呈多重耐药，不仅对甲氧西林、苯唑西林等β-内酰胺类耐药，也对大环内酯类、林可霉素类、氟喹诺酮类和庆大霉素等呈现耐药。1919协和医院40.3

%北京医院78.3%华山医院74.1%瑞金医院62.5%儿童医院22.9%儿科医院8.5%

浙医一院49.8%邵逸夫医院53.6%广医一附院33.6%武汉同济医院63.2%重医一附院61.9%院内MRSA在中国（2009

CHINETDATA）20“泛耐药”的鲍曼不动杆菌

Pandrugresistantacinetobacterbaumanii，PRDAB

医院感染的重要病原菌。增加ICU患者死亡率10~40%。

20-30℃环境下生长良好，抵抗力强，在干燥的物体表面鲍曼不动杆菌可存活25天，

远远超过其他革兰阴性杆菌21PDR-AB全球流行2010年，日本帝京大学医学部附属医院发生大规模的鲍曼不动杆菌感染事件。2003年，在阿富汗、伊拉克和科威特服役的美军医院中，外伤士兵不动杆菌感染率不断上升，造成严重的公共卫生问题/22伊拉克美军鲍曼不动杆菌肺炎沿幼发拉底河、底格里斯河分布

/map/map.htm23伊拉克美军带回的鲍曼不动杆菌在美国流行http://www.leishmaniasis.us/Mapping.html/2405-09年CHINET监测不动杆菌占革兰阴性菌比例25不动杆菌耐药性（CHINET数据）%year26后抗生素时代真的会来吗？细菌耐药可能将人类带回感染性疾病肆意横行的年代！2727抗菌药物的滥用

人类的贪婪和无知

你的滥用使我更加强大！28In1929Flemingsaid: "Thetimemaycomewhenpenicillincanbeboughtbyanyoneintheshops.Thenthereisthedangerthattheignorantmanmayeasilyunder-dosehimselfandbyexposinghismicrobestonon-lethalquantitiesofthedrugmakethemresistant."29MRSA的发生率与三代头孢使用量的关系美国纽约州30目前国内抗菌药物应用状况应用范围 应用类型有疑问的应用人类用住院患者中67％～82％

50%以上不需要

社区80%

农业用治疗性？%80%高度怀疑

预防或促生长80%WHO推荐：抗生素医院使用率为30％美英等发达国家医院：使用率22％～25％中国卫生部要求抗生素使用在50％以内中国每年生产抗生素原料约21万吨，人均年消费量是美国人的10倍。31314月9日CCTV（新闻联播）北京大学第一医院呼吸内科前一阵收治了一名普通的咳嗽患者，尽管医生竭尽全力为这位患者试用了多种类型的抗生素，都遏制不了病情的发展，最后上了万古霉素，可是还是没有效果。患者最终很快就死亡了。我们的医生们非常纳闷，究竟是什么原因？在死者家属的同意下，专家们对尸体进行了医学解剖研究，然而检查结果却出人意料！尸体解剖就发现他的体内存在着大量的耐药菌的感染，而这些耐药菌是对目前使用的这些抗生素是没有效果的！死者体内的那种致人死命的耐药菌又从何得来的呢？原来，他每天在单位食堂吃饭，顾虑单位食堂不干净，可能会有一些细菌在里面，所以每次吃完饭都要吃两粒抗生素，天天吃，日积月累，最后一个普通的感冒就结束了他的生命。32环境直接接触大环境全人类公共安全33基因突变获得外源基因耐药菌的播散诱导筛选抗菌药物的广泛应用为细菌耐药性形成埋下伏笔。34细菌耐药性产生的生化机制细菌耐药性形成的遗传机制

细菌耐药机制353636细菌耐药性产生的生化机制细菌产生抗生素灭活酶细菌改变抗菌药物作用的靶位细菌降低通透性阻止或减少抗生素进入菌体细菌增强主动外排系统，把进入菌体的抗生素泵出菌体外细菌生物被膜的形成对药物耐药的特异性？多重耐药？3737G－菌细胞壁肽聚糖肽聚糖肽链的交联由转肽酶、转糖基酶、羧肽酶，即PBPs等催化。G＋菌细胞壁肽聚糖肽聚糖特有的网状结构，承受细胞内高渗透压。底物：D-丙氨酰-D-丙氨酸3838β-内酰胺类抗生素构型与D-丙氨酰-D-丙氨酸相似β-的内酰胺环β-的内酰胺酶3939β-内酰胺青霉素类头孢菌素类头霉素类碳青霉烯类单环β-内酰胺类细菌对β-内酰胺类基本结构4040L.SilviaMunoz-Price&RobertA.Weinstein.NEnglJMed.2008;358:1271-81.通过细胞壁（外膜）达到膜壁间隙的能力；与靶位PBPs结合的能力；对β-内酰胺酶水解作用的稳定性。

产生β内酰胺酶改变PBPs改变菌膜通透性增强药物外排形成生物被膜4141β内酰胺酶生理功能：参与细胞壁的合成（微量），诱导合成。水解β内酰胺环；

与药物牢固结合（牵制机制）。β内酰胺酶抑制剂：

与β-内酰胺酶有较高的亲和性,β-内酰胺酶抑制剂本身没有或只有很弱的抗菌活性，但与其它ß-内酰胺类抗生素联合应用，则可发挥抑酶、保护、增效作用。克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦。β内酰胺酶与β内酰胺酶抑制剂4242以β-内酰胺酶的氨基酸序列为依据，将其分为四类：

A组：青霉素酶和超广谱β-内酰胺酶、羧苄青霉素酶、非金属碳青霉烯酶等，B组：金属酶或碳青霉烯酶，C组：头孢菌素酶（AmpC酶），

D组：青霉素酶，包括邻氯青霉素酶（OXA）、苯唑西林水解酶。A组被克拉维酸抑制B、C、D组不被克拉维酸抑制。4343青霉素酶（A组）

底物谱窄：青霉素G（天然青霉素）；酶抑制剂：被克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦抑制为G+菌产生，约90%的葡萄球菌菌株能产生青霉素酶对产生此酶的细菌可用的β-内酰胺类药物？4444超广谱β-内酰胺酶（A组）

Extended-Spectyumβ-Lactamase，ESBLs底物谱广：青霉素类，头孢菌素、单环酰胺类。种类多，已报道的TEM类ESBIs已有90多种，

SHV类ESBLs多于25种。质粒介导，易在不同菌株之间相互传播。酶抑制剂：多数可被克拉维酸、他唑巴坦及舒巴坦所抑制。对产生此酶的细菌可用的β-内酰胺类药物？头霉素、碳青酶烯类；复合制剂当前细菌耐药的主要趋势之一454546464747

头孢菌素酶（AmpC酶）（C组）

（amoxicillin，AmpC，羟氨苄青霉素）底物谱广：碳青霉烯类以外的所有β-内酰胺类抗生素。不被β内酰胺酶抑制剂所抑制，对产生此酶的细菌可用的β-内酰胺类药物？常见菌：G－菌杆菌由染色体或质粒介导产生，耐药性易传播。对临床危害大，引起院内感染。仅碳青霉烯类4848金属β-内酰胺酶（碳青霉烯酶）

(metallo-be-ta-lactamases,MBLs),

酶活性中心需金属锌离子参与现在已报道了10多种可转移的金属酶:IMP21～8和VIM21～3，底物谱更广：所有β-内酰胺类抗生素广泛耐药不被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦抑制，可被乙二胺四乙酸（EDTA，毒性？）抑制。49492010年8月11日的《柳叶刀》杂志发表论文：

印度、巴基斯坦、英国发现新的病原菌耐药机制肺炎克雷伯菌携带金属β-内酰胺酶基因，也称新德里-金属β-内酰胺酶基因1（NewDelhiMetalo-1，NDM-1）。质粒介导。该菌对所有β-内酰胺类抗生素广泛耐药。对环丙沙星也不敏感，仅对多粘菌素敏感。5050MBLs在世界的发现EnzymeStrainDiscoveryinIMP（28）S.marcescens,P.aeruginosa,A.baumanni,EnterobacteriaceaeJapan1994VIM（26）P.aeruginosa,A.baumanni,EnterobacteriaceaeVerona,Italy1999SPM-1（1）P.aeruginosaBrazil2002GIM-1（1）P.aeruginosaGermany2004SIM-1（1）A.baumanniKorea2005AIM-1（1）P.aeruginosaAustrailia2007KHM-1（1）CitrobacterfreundiiJapan2008NDM-1（1）K.pneumoniae,E.coli,EnterobactercloacaeIndia,UK2009DIM-1（1）PseudomonasstutzeriDutch20105151我国碳青霉烯类抗生素不敏感菌株中的金属酶分布，

（2006－2007年，16个城市，28家医院）CityMBLsgenotypestrainsGuangzhou

IMP-913VIM-21Hangzhou

IMP-11VIM-21ShijiazhuangVIM-24TianjinVIM-22ShanghaiVIM-21WuhanVIM-2152522005-2010年CHINET耐药监测肺炎克雷伯菌

对碳青霉烯类的耐药率（%）肺杆株数2005213620062834200730372008343520094556201020935353β-内酰胺类药物与β-内酰胺酶

酶抗生素青霉素酶超广谱β-内酰胺酶ESBLs头孢菌素酶AmpC酶金属β-内酰胺酶MBLs青霉素类分解分解分解分解头孢菌素类稳定分解分解（除第三、四代）分解碳青霉烯类稳定稳定稳定分解被酶抑制剂所抑制能能不能不能目前最后的防线545455552、PBPs的改变正常PBPs：PBP1，PBP2，PBP3，PBP3’，PBP4PBP2aPBP-2’MRSA表葡菌PBP1a/1bPBP2a/2x/2b肺炎链球菌5种相似PBP

肠球菌与抗生素亲和力降低5656L.SilviaMunoz-Price&RobertA.Weinstein.NEnglJMed.2008;358:1271-81.3、外膜通透性改变非特异性孔径：OmpF(直径1.16nm)，OmpC(直径1.08nm)特异性孔径：OprD，铜绿假单胞菌对碳青霉烯类57theexpressionlevelofOprD2

amongPseudomonasaeruginosa

19.33％

46.47％

34.2％

Note：significantdecreaseintheexpressionofOprD2(<0.4)5858L.SilviaMunoz-Price&RobertA.Weinstein.NEnglJMed.2008;358:1271-81.4、药物主动外排系统（activedrugefflux)

59内膜转运蛋白内膜膜融合蛋白4、药物主动外排系统（activedrugefflux)

介导低水平、多重耐药，如对β-内酰胺类，大环内酯类，四环素类、氯霉素类及喹诺酮类耐药。主动泵出系统过度表达，也可致高水平耐药。6060李显志

6161铜绿假单胞菌

外排系统内膜转运体(MexB、MexD、MexF、MexY、MexI和MexW)膜融合蛋白(MexA、MexC、MexE、MexX、MexJ、MexH等）外膜蛋白(OprM、OprJ、OprN和OpmD)外排系统：如MexAB-OprM，MexAB-OprJ6262636464降低细菌固有耐药水平，逆转获得性耐药。通过抑制ATP

：利血平、维拉帕米、环孢素A、他莫昔芬。与膜蛋白结合的：N右旋维拉帕米等。抑制质子梯度外排泵的外排作用：质子动力解偶联剂氰氯苯腙(cccp)等。EPIs有望成为恢复菌体对药物的敏感性、提高临床疗效的一类新药。外排泵抑制(efflux

pump

inhibitor,

EPI)65655.细菌生物被膜（biofilm,BF）的形成6666

铜绿假单胞菌生物被膜结晶紫染色光镜照片（×1000倍）1d7d6d4d3d2d67“InapaperinSciencein1999,wesaid65percentofalldiseasesinthedevelopedworldarebiofilms,”Costertonsaid.“NowtheNIHsays80percent.”J.WilliamCosterton

6868感染或疾病形成菌膜的细菌牙龋产酸革兰氏阳性球菌（如链球菌）牙周炎革兰氏阴性厌氧口腔细菌中耳炎非典型流感噬血杆菌肌骨骼感染革兰氏阳性球菌（如葡萄球菌）坏死性筋膜炎A组链球菌胆道感染肠细菌（如大肠埃希氏菌）骨髓炎多种细菌和真菌，通常是混合感染细菌性前列腺炎大肠埃希氏菌和其它革兰氏阴性细菌囊纤微化肺炎铜绿假单胞菌及洋葱克雷伯氏菌生物被膜菌的临床感染6969医院内感染监护病房肺炎缝术Exitsites动静脉分流术Schleralbuckles隐形眼镜泌尿导管膀胱炎腹膜透析腹膜炎宫内节育器气管内管Hichman

导管中枢神经导管机械心脏阀血管移植胆道stent阻滞矫形外科装置阴茎假体形成菌膜的细菌革兰氏阴性杆菌表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌铜绿假单胞菌和其它革兰氏阳性球菌大肠埃希氏菌和其它革兰氏阴性杆菌各种细菌和真菌衣氏放线菌和其它许多菌各种细菌和真菌表皮葡萄球菌和白念珠菌表皮葡萄球菌和其它细菌金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌革兰氏阳性球菌各种肠道细菌和真菌金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌7070生物被膜菌的临床感染细菌生物被膜的形成速度缓慢，由菌膜引起的感染出现明显症状的时间较长。但当在菌膜内释放出的细菌，则可引起急性感染。具有极强的耐药性（增加10-1000倍）。增强细菌的免疫逃避。生物被膜的形成是许多慢性和难治性感染疾病的反复发作的主要原因。7171细菌生物被膜的耐药性机制

生物被膜对抗生素的屏障作用，生物被膜内特殊的生态环境使细菌对抗菌药物敏感性降低，使抗生素的活性减低。表型突变株和耐药株的形成。72

Niels

Hoiby.DepartmentofClinicalMicrobiology,RigshospitaletandInstituteofMedicalMicrobiologyandImmunology,JulianeMariesVej22,UniversityofCopenhagen,Copenhagen,Denmark.7374757676

Highβ-LactamaseLevelsChangethePharmacodynamicsofβ-LactamAntibioticsinPseudomonasaeruginosaBiofilms.

WangHengzhuang,OanaCiofu,LiangYang,HongWu,ZhijunSong,AntonioOliver,andNielsHøiby.Antimicrob.AgentsChemother.,Jan2013;57:196-204.

7778RepresentativeERIC-PCRpatternsforP.aeruginose

genomicDNAsanddendrogramillustratingtheclusteringofpatternsbypercentsimilarity(shownattherightofthedendrogram).WeiqingYang,LShi,WXJia.EvaluationoftheBiofilm-FormingAbilityandGeneticTypingforClinicalIsolatesofPseudomonasaeruginosa

byEnterobacterialRepetitiveIntergenicConsensusSequencePCR.MicrobiolImmunol,Jan2005;49(12):1057-61.79细菌耐药性形成的遗传机制基因突变获得外源基因细菌基因组中可移动的基因元件：

转座子，整合子。细菌间耐药基因的转移：通过接合、转化、转导等方式转移质粒或染色体片段。细菌间基因的友好分享80中国KPC-2传播的Tn1721转座子结构

抗性基因81

Integronsaregeneticelementthatcanintegratebysite-specificrecombination,andexpressgenecassettes,usuallyantibioticresistancegenes.StokesHW，HallRM．ANovelfamilyofpotentiallymobileDNAelementsencodingsite-specificgeneintegrationfunctions：integrons．Microbial，1989．具有位点特异性重组功能，能捕获和整合外源基因，并可启动所携带基因的表达的DNA片段。整合子（integron，In）82825’3’intIgene2gene1

整合子结构示意图attIABCP1P2P5´3´geneRYYYAACGTTRRRYattCattC5’端保守区（5CS）3’端保守区（3CS）中间的可变区域：1个或多个基因盒

组成8383

基因盒（genecassettes）：可移动的小分子DNA，有由一个结构基因和一个特异性重组位点attC组成attC的两端为7个bp的回文序列目前发现的基因盒携带的基因绝大多数为

耐药基因。geneattC84基因盒有两种存在形式：

geneattCgeneattC整合状态的线性分子游离状态的环状分子85attIintIPantPintIntegrasegene+resistancegene1Int+resistancegene2IntR1R2R1R1Schematicrepresentationofthemodelforcassetteexchangeandexpression86

耐药基因

IR转位酶基因

IRSul1intI1attI1耐药基因

attcqacE△1ORF5整合子整合子与转座子的比较：

IR转位酶基因

IR转座子（Tn）：87Theepidemiologyofintegrons整合子类型1类整合子 2类整合子 3类整合子 超级整合子

菌种

肠杆菌科 肠杆菌科 铜绿假单胞菌霍乱弧菌

铜绿假单胞菌 不动杆菌属 粘质沙雷菌 假单胞菌属 不动杆菌属 铜绿假单胞菌 木糖氧化产碱杆菌黄单胞菌属 霍乱弧菌 恶臭假单胞菌亚硝化单孢菌属 空肠弯曲菌 肺炎克雷伯菌 谷氨酸棒状杆菌 粪肠球菌 基因盒相关耐药β内酰胺类耐药 氨基糖苷类耐药 β内酰胺类耐药 ???? A,C,D类β内酰胺酶 3″2腺苷酰基转移酶 氨基糖苷类耐药

B类β内酰胺酶 链丝菌素耐药 6-转乙酰酶

氨基糖苷类耐药 转乙酰酶

6′－转乙酰酶 磺胺耐药

3－转乙酰酶 A类和

2－腺苷酰基转移酶 二氢叶酸还原酶

3－腺苷酰基转移酶 氯霉素耐药 转乙酰酶 非酶作用机制 磺胺耐药

A类和B类二氢叶酸还原酶 利福平耐药

ADP-核糖基转移酶 红霉素耐药 季铵类化合物耐药88Fig.TheelectrophoresisofPCRproductsofclass1integratedgenecassttesanong

P.aeruginosa

isolates.引自黄娟硕士论文89TheAnalysisandcomparisonofthesequencingresults引自黄娟硕士论文ABC转运系统蛋白编码噬菌体蛋白的序列90整合子的移动整合子存在于质粒、转座子或染色体上，可随转座子在染色体和质粒间移动；可随质粒在细菌间转移。整合子可以被切除和整合基因盒。在细菌耐药播散中发挥重要作用。在细菌多重耐药的形成中发挥重要作用。91关于耐药基因转移元件形成的推测：单个基因自发突变(耐药基因)其mRNA逆转录产物作为基因盒被细菌染色体上的整合子捕获多个耐药基因被捕获，形成多重耐药

转座子转位至质粒，导致R质粒的形成整合子两端插入IS转变为转座子92drug-resistanceplasmid,R质粒93接合Conjugation：

接合转移可在同种菌之间进行，也可在属间不同种菌之间进行通过接合方式，转移质粒及染色体片段.一次可完成对多种抗菌药耐药性的转移。主要出现在G－细菌中，特别是在肠道菌。94

转化(transformation):游离的耐药基因DNA片段：

抗生素产生菌的耐药基因片段耐药菌溶解后释放出的耐药基因片段，耐药基因直接进入敏感菌（感受态时）内，与敏感菌的基因发生重组，使敏感菌成为耐药菌。常见于G-菌间。95借助于噬菌体将耐药基因转移给敏感菌，由于噬菌体有特异性，且通过噬菌体传播的DNA量很少，因此耐药性的转导现象仅能发生在同种细菌之间，通常仅能传递对一