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文档简介
(四)梭状芽胞杆菌属厌氧芽胞杆菌(anaerobicsporeformingbacilli)只有一个属,即梭状芽胞杆菌属,简称梭菌属(Clostridum)。本属具有130个种的一大群厌氧或微需氧的粗大芽胞杆菌。革兰染色阳性,但在陈旧培养物中菌体革兰染色常为阴性,芽胞正圆形或卵圆形,直径大于菌体,位于菌体中央,极端或次极端,使菌体膨大呈梭状,故名。临床有致病性的梭菌主要有破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌与艰难梭菌。它们分别引起人类破伤风、气性坏疽、食物中毒和假膜性结肠炎等。一、破伤风梭菌破伤风梭菌(C.tetani)是梭菌属中常见的一种芽胞杆菌,因它引起的疾病叫破伤风,故名。(一)临床意义
破伤风梭菌广泛存在于自然界,当机体受创伤时或新生儿接生时使用不洁用具断脐带,破伤风梭菌可侵入伤口生长繁殖,分泌外毒素(痉挛毒素)。该毒素能封闭脊髓抑制性触突,从而阻止了抑制性突触末端释放抑制性冲动的传递介质,而破坏了正常的抑制性调节功能,从而引起骨骼肌强直性痉挛、抽搐,称为破伤风/脐带风。破伤风痉挛毒素◆结构及功能菌体内时为一条完整的多肽链释出菌体时,被裂解为轻链(A链)重链(B链)A链则具有毒性作用B链是与神经节苷脂结合的部位阻止抑制性神经介质的释放特有的临床表现全世界每年约有100万病例发生,死亡率在20%左右。新生儿破伤风又称为脐带风或闭口风,在发展中国家,死亡率可高达90%。破伤风——角弓反张破伤风——苦笑面容(二)微生物学检验形态与染色
细长,有周鞭毛,能运动。无荚膜。芽胞正圆形,比菌体大,位于菌体顶端,使细菌呈鼓槌状,为本菌特征。
G+
48h
G-1.微生物特性图1-5破伤风杆菌纯培养晚期的镜下形态
(48小时革兰染色)培养特征
为专性厌氧菌。在血平板上37℃培养48h,始见薄膜状爬行物生长,伴β溶血。如在疱肉培养基中,肉渣部分消化,微变黑,有少量气体。生成甲基硫醇及H2S,有腐败性恶臭味。生化的反应
本菌一般不发酵糖类,能液化明胶。产生H2S,形成吲哚,不还原硝酸盐,对蛋白质有微弱的消化作用。气液相色谱可检出的代谢产物有乙酸、丙酸和丁酸、乙醇和丁醇。抗原构造
本菌有菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原。菌体抗原各型相同,而鞭毛抗原有型的特异性。据鞭毛抗原不同,可分为10个血清型。各型菌所产生毒素的生物活性与免疫活性均相同,可被任何型抗毒素中和。抵抗力
本菌繁殖体抵抗力与其他细菌相似,但芽胞抵抗力甚强,在土壤中数年不死,煮沸100℃1h可被杀灭,能耐干热150℃1h,50g/L的石炭酸10~15h。对青霉素、红霉素、四环素敏感,磺胺类有抑制作用,对氨基糖苷抗生素耐药。2.微生物检验根据破伤风的典型临床表现即可作出诊断,故一般不作细菌学检查。必要时可通过直接涂片镜检、厌氧培养和毒力试验进行微生物检验。检验结果分析与报告
一般取伤口分泌物涂片、染色,如见到典型的革兰阳性鼓槌样菌,即可报告:“检出破伤风梭菌”。如取标本直接涂片、镜检,菌体形态不典型或菌甚少,难以判定时,则可进行分离培养、动物试验,如果试验结果阳性,则可报告:“经×天培养出破伤风梭菌”和“破伤风抗毒素试验阳性”。2.产气荚膜梭菌(一)临床意义(二)微生物检验产气荚膜梭菌是气性坏疽的主要病原菌。本菌可产生外毒素及多种侵袭性酶类。外毒素有α、β、γ等12种。其中最重要的是α毒素(卵磷脂酶),引起溶血、组织坏死和血管内皮损伤,使血管通透性增高,造成水肿。同时,α毒素还能促使血小板凝聚,导致血栓形成,局部组织缺血。(一)临床意义所致疾病主要是气性坏疽,某些型别也可引起食物中毒和坏死性肠炎。也常与兼性厌氧菌混合感染,引起深部脓肿、败血症、胸腔的感染等。除产气荚膜梭菌外,还有诺维梭菌(C.novyi)、败毒梭菌(C.septicum)和溶组织梭菌(C.histolyticum)等也是气性坏疽的病原菌。1微生物特性形态与染色
产气荚膜梭菌(C.perfringens)又叫魏氏梭菌(C.Welchii),为G+杆菌,两端钝圆,单个或成双排列,偶见长丝状。芽胞椭圆形,位于菌体中央或次极端,芽胞直径不大于菌体,在一般培养时不易形成芽胞,在无糖培养基中有利于形成芽胞。在机体内可产生明显的荚膜。无鞭毛。(二)微生物学检验图1-6产气荚膜梭菌纯培养的镜下形态
(革兰染色)培养特征
对厌氧要求不严格,繁殖迅速。培养2h后,在液体培养基深层即有明显生长;经4~6h孵育后出现表面生长。在固体培养基上,经24h培养,表面菌落直径2~4mm,圆形、凸起、光滑、半透明、边缘整齐、无迁徙生长现象。在血平板上,多数菌株有双层溶血环,有试验表明,内环完全溶血,是由于θ毒素的作用;外环不完全溶血则是由α毒素所致。在蛋黄琼脂平板上,菌落周围出现乳白色混浊圈。是由于此菌产生的卵磷脂酶分解蛋黄中的卵磷脂,可被特异的抗血清所中和,这一现象称为Nagler反应。在庖肉培养基中产生气体,肉渣呈粉红色,不被消化。在牛乳培养基中能分解乳糖产酸,使酪蛋白凝固,同时产生大量气体(H2与CO2),将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状,并将液面上的凡士林层向上推挤,甚至冲开管口棉塞,气势凶猛,称为“汹涌发酵”(stormyfermentation),是此菌的特征。生化反应
所有型菌株均能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖,产酸产气。不发酵甘露醇或水杨苷;液化明胶,产生H2S,不能消化已凝固的蛋白质和血清,吲哚阴性。主要代谢产物为乙酸和丁酸,有时也形成丁醇。分型
根据细菌产生外毒素种类之不同,可将产气荚膜梭菌分成A、B、C、D、E5个毒素型。5型中对人致病的主要是A型和C型,A型最常见,引起气性坏疽和胃肠炎型食物中毒;C型则可引起坏死性肠炎。2.微生物检验检验程序标本的采集
一般采取创伤深部的分泌物、穿刺物、坏死组织块;菌血症时期的血液、可疑食物。其中坏死组织等固体应研磨制成悬液。
标本涂片革兰染色镜检疱肉基等血平板可疑菌落涂片革兰染色镜检庖肉培养基动物实验血斜面生化反应牛奶培养基(汹涌发酵)在创伤标本的涂片中不一定经常见到产气荚膜梭菌的荚膜;一般在流产后感染产气荚膜梭菌的宫颈涂片上较易查见。芽胞不经常看到。直接涂片镜检深部创口取材涂片革兰阳性大杆菌白细胞甚少且形态不典型伴有其它杂菌分离培养与鉴定
厌氧培养本菌对低浓度氧有耐性,生长迅速,故容易分离。标本可接种于庖肉培养基或血平板和卵黄琼脂平板。在庖肉培养基中培养8~10h后,转种于血平板和卵黄琼脂平板。鉴定1)形态特征和缺少芽胞,有荚膜特征。2)菌落特征和糖发酵反应,特别是“汹涌发酵”现象。3)Nagler试验4)动物试验
5)挥发性代谢产物的测定产气荚膜梭菌的重要代谢产物为乙酸和丁酸。6)与其他梭菌的鉴别。“泡沫肝”将培养物0.5-1.0ml,注入家兔或小鼠静脉内,10min后杀死动物,置37℃培养5-8h。如动物躯体膨胀,即行解剖,可见脏器和肌肉内有大量气泡,尤其以肝脏最为明显,称为“泡沫肝”检验结果分析与报告厌氧培养有细菌生长,可根据形态染色特点得出初步判断,然后根据鉴定依据各项指标进行最后鉴定,并作出报告:“厌氧培养有产气荚膜梭菌生长”。如无细菌生长,应继续培养7天,仍无细菌生长时,即可报告:“厌氧培养7天后无细菌生长”。3.肉毒梭菌(一)临床意义(二)微生物检验肉毒梭菌广泛存在于自然界,土壤中尚可检出,偶尔存在于动物粪便中。本菌在厌氧条件下可产生极其强烈的外毒素—肉毒毒素。该毒素可以阻止胆碱能神经末梢释放乙酰胆碱,导致肌肉麻痹。重者可死于呼吸困难与心力衰竭。(一)临床意义这种毒素型食物中毒在中国有10多个省区均有发现,新疆较多。引起食物中毒的食品国外以罐头、腊肠、香肠等制品为主,国内以发酵豆制品为主(占80%以上),其次为发酵面制品(占10%左右)。本菌尚可使1岁以下婴幼儿患婴儿肉毒症。此外,也有因肉毒梭菌感染伤口或因手术改变了胃肠道环境的成年人由本菌定植而产生肉毒病的报告。1.微生物特性肉毒梭菌(C.botulinum)分8个毒素型,其中A、B、E、F型对人致病,A、B型最常见。根据遗传特性分为Ⅰ~Ⅳ组,Ⅰ、Ⅱ组可引起人类疾病,Ⅰ组多见。因主要引起人和动物肉毒症,故名。(二)微生物学检验肉毒毒素是目前已知毒物中毒性最强者,其毒性比氰化钾强
倍,肉毒毒素对人的致死量为0.1~1.0μg。该毒素为蛋白质,具有一定的耐热性,80~90℃加热5~10min或煮沸1min可破坏。国内报告的大多是A型。各型毒素抗原性不同,只能被同型的抗毒素中和。各型毒素的药理作用都是相同的。一万形态与染色
肉毒梭菌为革兰阳性粗短杆菌,单独或成双排列,有时可见短链状。有周身鞭毛,无荚膜。20~25℃时在菌体次极端形成椭圆形芽胞,芽胞大于菌体,使细菌呈汤匙状或网球拍状。图1-7肉毒梭菌纯培养的镜下形态(革兰染色)培养特性
严格厌氧,在普通琼脂平板上形成直径3~5mm不规则菌落,能产生脂酶,在血平板上有β溶血,在卵黄平板上,菌落周围出现浑浊圈。能消化肉渣,使之变黑,有腐败恶臭。生化反应
该菌生化特性随毒素型不同而有所差异。在病原性梭菌中,本菌的特征是发酵蔗糖,不发酵乳糖。各型均液化明胶,产生H2S,但不产生吲哚。除G型外均产生脂肪酶,都能溶血,一般不产生卵磷脂酶。气液相色谱分析,各型均可产生乙酸和丁酸,其它有机酸则随型而有所不同。抵抗力
本菌芽胞抵抗力很强,可耐热100℃1h以上。2.微生物检验肉毒梭菌引起的食物中毒,其诊断主要通过检出毒素,因肉毒梭菌本身并不致病。一般在检查毒素的同时作细菌分离培养,并检测分离细菌产生毒素的能力和性质。检验程序(见书本)标本的采集
无菌抽取患者血液,分离血清,从患者血清中检出毒素是最直接最有效的方法。其次应采取的标本是患者粪便,从中检出毒素,分离肉毒梭菌,也很有助于临床诊断。从中毒媒介食品中检出毒素最容易,采取可疑食品作为送检标本颇为重要。外伤感染性肉毒中毒患者的伤口坏死组织或渗出液也可供作检验标本。供作食品卫生检验的标本主要是罐头食品、发酵食品以及其它需要检验的食品,包括毒素检出或细菌分离鉴定。标本直接检查
因本菌主要靠肉毒毒素致病,故直接涂片镜检意义不大。分离培养与鉴定分离培养
本菌要获得纯培养比较困难。常用增菌方法,以促进混合培养物中肉毒梭菌的生长和毒素的产生,再经动物接种和保护性试验,以证明毒素的性质。毒素的型别鉴定,须用分型血清作中和试验和反向间接血凝试验。鉴定①涂片镜检为革兰阳性次极端芽胞,呈汤匙状。②厌氧,消化肉渣且变黑,产生恶臭味。③菌落边缘有皱褶。④肉毒素检测试验阳性。⑤与其他梭菌鉴别见书。检验结果分析与报告若从标本或培养物中检出肉毒毒素,则可报告:“从××中检出肉毒毒素”,有肯定诊断价值。标本37℃厌氧培养48~72h后,若有菌生长,经分离培养后,如符合鉴定依据,可报告:“厌氧培养有肉毒梭菌生长”,并同时作毒素测定。如无菌生长,应继续培养7d,仍无菌生长时,即可报告:“经7d厌氧培养无肉毒梭菌生长”。4.艰难梭菌(一)临床意义(二)微生物检验(一)临床意义艰难梭菌是人和动物肠道寄生菌,在幼儿的粪便中最常见,为肠道正常菌群的成员。此菌对氨苄青霉素、头孢菌素、林可霉素、氯林可霉素、红霉素、四环素耐药。长期使用这些抗生素,引起菌群失调,造成假膜性结肠炎。
临床表现为腹泻、腹痛、伴有全身中毒症状,常较严重,有时可致死。除假膜性结肠炎外,艰难梭菌尚可引起肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔及阴道感染、菌血症和气性坏疽等。近年日益重视。1.微生物特性艰难梭菌(C.difficile)是梭菌属中的一种专性厌氧菌,对氧十分敏感,很难分离培养,故名。形态与染色本菌为粗长杆菌,大小约1.3~1.6μm×3.6~6.4μm,能运动或不能运动,运动性菌株为周毛菌。芽胞为卵圆形,位于菌体次极端,无荚膜,革兰染色阳性,但培养2d后有转为阴性趋向。(二)微生物学检验图1-8艰难梭菌纯培养的镜下形态(革兰染色)培养特性
本菌为严格的专性厌氧菌,用常规的厌氧培养法不易生长。生长最适温度为30~37℃。在血琼脂、牛心脑浸液琼脂及CCFA(cycloserine-cefoxitin–fructose-agar)等平板上,经48h培养后,菌落直径3~5mm,圆形,略凸起,白色或淡黄色、不透明、边缘不整齐、表面粗糙。在血平板上不溶血,在卵黄琼脂平板上不形成乳浊环。CCFA平板上的菌落,在紫外线照射下,可见黄绿色荧光。本菌经肉汤培养2d以上,菌体有溶融现象。生化反应
不分解蛋白质,发酵葡萄糖、果糖、甘露醇,产酸。水解七叶苷,液
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