临床免疫学检验：10 免疫细胞功能检测

第十三章免疫细胞分离与免疫细胞功能检测

P134免疫细胞分离技术外周血单个核细胞分离---密度梯度离心法

原理：不同血细胞由于体积、形态、比重的不同，将其置于同一种离心力作用下，经过一定时间离心，它们就会分在不同的层次中。红细胞和粒细胞比重为1.092左右；淋巴细胞和单核细胞（统称为单个核细胞PBMC）比重为1.075~，为此，利用比重介于二者之间的淋巴细胞分离液（1.077±0.001）做密度梯度离心，可将单个核细胞分离出来。

常用的分离液－淋巴细胞分离液由聚蔗糖（Ficoll)和泛影葡胺（Hypaque)组成，故又称为Ficoll-Hypaque分离液或Ficoll分离液。

Ficoll液的比重为1.077±0.001。稀释血淋巴细胞分离液血浆+Hanks液淋巴细胞分离液RBC+粒细胞单个核细胞离心20分钟2000转

Ficoll液密度梯度离心分离单个核细胞示意图密度梯度离心法分离单个核细胞T/B细胞及T细胞亚群的分离---

免疫磁珠法原理：基于细胞表面Ag与连接有磁珠的特异性McAb结合，形成细胞-Ab-磁珠复合物，与磁珠相连的细胞在外加磁场作用下被吸附而滞留于磁场；而无该种表面Ag的细胞由于不能与连接有磁珠的特异性McAb结合而没有磁性，不能在磁场停留，从而使细胞分离。免疫磁珠分离细胞原理示意图

淋巴细胞功能检测

一.非特异性免疫应答（固有性免疫应答，innateimmuneresponse)（一）概念

：人类在种系发展过程中形成的并可遗传给后代的免疫力，它是天生具有的，不专门针对某种Ag物质。（二）特点：

1.先天获得，人人皆有；比较稳定，并可遗传给下一代

2.不因同一抗原进入机体次数多少改变反应强弱

3.发挥作用迅速

免疫应答的类型及组成分两种类型一.非特异性免疫应答二.特异性免疫应答（三）组成1.皮肤、黏膜的机械阻挡作用及局部分泌的抑菌、杀菌物质2.吞噬细胞的吞噬作用3.NK(naturekiller)细胞对病毒感染靶细胞的杀伤作用4.血液、体液中的抗菌分子：补体、溶菌酶二.特异性免疫应答（适应性免疫应答，adaptiveimmuneresponse)（一）概念：具有特异性，即针对某一特定的Ag物质而发生反应，包括细胞免疫和体液免疫（二）特点：

1.后天获得

2.有明显的个体差异

3.免疫发生强弱与抗原进入次数有关（三）组成细胞免疫：由TLC主导完成，其效应物质是致敏TLC(CTL/Th1)体液免疫：由BLC主导完成，其效应物质是Ab第二节人体免疫功能检测非特异免疫功能体液中杀菌物质——补体、溶菌酶吞噬细胞——大、小吞噬细胞（数量、功能）

特异性免疫功能细胞免疫功能T细胞数量功能体液免疫功能B细胞数量功能人特异免疫功能的检测一.T细胞数量的检测二.T细胞功能的检测三.B细胞数量的检测四.B细胞功能的检测一.T细胞的计数（T细胞表面标志的检测）（一）特异性抗原的检测

淋巴细胞表面有一些特异的CD抗原，根据不同的CD抗原可鉴定出不同的细胞群体CD抗原：淋巴细胞群（簇）分化抗原：不同群淋巴细胞在分化成熟过程中，细胞表面出现或消失的抗原分子T细胞表面主要CD抗原及其特异性

CD抗原特异性

CD2

E受体、全部T细胞和部分NK细胞

CD3

成熟T细胞

CD4

Th（辅助）细胞、M、HIV受体

CD8

Tc（杀伤）细胞、NK细胞的亚型

CD25活化T细胞、IL-2受体

检测T淋巴细胞表面CD抗原中:CD3+的数量表示成熟的总T淋巴细胞的数量CD4+的数量表示是Th细胞的数量CD8+的数量表示是Ts/CTL细胞的数量CD4+/CD8+≥1.5免疫功能差或者免疫功能紊乱，该比值往往小于1。检测方法：

用已标记的抗CD抗原的单克隆抗体检测1.免疫荧光法：用荧光素标记的单抗作为试剂染色淋巴细胞，计算出染上荧光的淋巴细胞百分率如：荧光标记的抗CD4单抗

淋巴细胞

染上荧光的为CD4+细胞

染色2.免疫细胞化学法：

用酶标记的单抗检测淋巴细胞

淋巴细胞印片

淋巴细胞，淋巴细胞表面CD抗原与相应单抗结合

加底物细胞上有颜色即为阳性细胞

用酶标记的单抗洗涤染色（二）T细胞特异性受体（E受体）的检测

E花环形成试验(ErythrocyteRosetteformingtest)原理：

T淋巴细胞表面含有绵羊红细胞（SRBC)受体（CD2)，当T淋巴细胞与绵羊红细胞相遇时，T细胞通过该受体吸附绵羊红细胞而形成花环。

E:erythrocyte,红细胞E花环形成试验据实验条件不同又分两种：

Et花环形成试验（total,总E花环）

Ea花环形成试验（active,活性E花环）1.Et花环形成试验淋巴细胞+SRBC(1:50~100)37°C

、5min低速离心4°C、2h

计数形成花环百分率意义：代表T细胞总数（凡是T细胞均能形成花环），数量低于正常，说明细胞免疫功能差。

正常值：60%~80%2.Ea花环形成试验淋巴细胞+SRBC(1:8-20)37C、5min低速离心4°C、10min

计数形成花环百分率意义：能形成Ea花环的T细胞是活性强的T细胞，Ea花环形成率更能反映细胞免疫功能。正常值：20%~30%

二.T细胞功能的检测

检测T细胞功能的试验有：（一）T细胞增殖转化试验（二）T细胞分泌功能测定（细胞因子检测）（三）T细胞介导的细胞毒性检测（一）T细胞增殖转化试验1.原理

淋巴细胞在某些物质刺激下，细胞增殖、分化（如细胞变大、胞浆增多、出现空泡）DNA合成增加（核染色质疏松，核仁出现），转化成为淋巴母细胞。

2.刺激物

一般分有丝分裂原（非抗原）和抗原两类：（1）非抗原刺激物（有丝分裂原）可刺激相关淋巴细胞发生增殖转化，与机体是否曾受过某一抗原致敏无关。

非抗原刺激物

刺激物能刺激发生转化的细胞

植物血凝素（PHA)T

刀豆素A(ConA)T

脂多糖(LPS)、SPAB

商陆丝裂原(PWM)T、B（2）抗原刺激物

只能使曾经被相应抗原刺激（致敏）过的淋巴细胞发生增殖转化。3.试验方法（1）形态学检测法

抽取待测者血，加入PHA进行培养，3天后涂片染色，计数100个LC中转化的淋巴细胞即淋巴母细胞（根据形态）百分率。正常值60%～80%操作过程：试验管:抗凝血2-3ml+PHA2mg+培养液对照管：抗凝血+培养液37°C

5%co2培养3天涂片染色计数100个LC中转化淋巴细胞的百分率转化与未转化淋巴细胞的区别转化细胞未转化细胞特点母细胞过渡型小淋巴细胞细胞大小（直径）12~20µ12~16µ6~8µ

胞核染色质疏松疏松致密核仁1~3个有或无无分裂相有或无无无量丰富稍宽窄嗜碱性强、深兰色兰色天青兰空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无

胞浆形态学方法的优缺点优点：操作简便、不需特殊仪器，无有害物质（放射性物质）污染。缺点：判断结果不客观，受主观因素影响，结果判断难以规范化。（2）同位素掺入法（

3H-TdR掺入法）原理：

T细胞受PHA刺激后，细胞进入增殖期发生有丝分裂合成DNA。实验中当细胞进入S期时，在培养液中加入3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR)，细胞摄入合成DNA，根据掺入细胞内的同位素量，可推测细胞增殖转化程度。步骤：外周血分离淋巴细胞洗涤3次计数并配成1×106/ml0.1ml细胞+16400.1ml+PHA0.5mg/ml37°C

54-56h5%co2加3H-TdR1µci/孔37°C

16-18h5%co2收集细胞于滤膜上80~85°C

30min置有闪烁液的闪烁瓶中用闪烁计数仪测cpm（每分钟脉冲数）结果：计算刺激指数刺激指数(SI)=

实验组cpm对照组cpm正常值：SI3.0同位素掺入法的优缺点优点：结果客观准确，有取代形态学法的趋势缺点：技术要求高，操作中每个因素的改变都可影响实验结果；需要特殊仪器检测；存在同位素污染问题（3）MTT比色法

MTT—四甲基偶氮唑盐

淋巴细胞受PHA刺激培养中，细胞增殖活跃，在细胞培养终止前4~6h（66-68h)加入MTT，继续培养。

原理：MTT在细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的作用下，被还原成蓝黑色的MTT-甲瓒颗粒，形成的MTT-甲瓒量与细胞增殖程度呈正相关。终止培养后加入二甲亚砜，使其溶解。在酶标仪上测A570nm，可反映细胞增殖水平。结果：以刺激指数SI判断淋巴细胞增殖程度。

SI=试验孔A570nm/对照孔A570nm本法敏感性不及3H-TdR掺入法，但操作简单，无放射性污染。（二）T细胞介导的细胞毒试验

细胞毒性T细胞（CTL)具有杀伤靶细胞的功能，它是评价机体细胞免疫水平的指标。检测该杀伤作用的试验称为细胞毒试验。CTL与靶细胞表面相应抗原结合通过脱颗粒，释放穿孔素、颗粒酶；FasL/Fas介导，使靶细胞溶解、凋亡。CTLCD8+靶细胞穿孔素、颗粒酶FasL/Fas介导靶细胞溶解、凋亡致敏淋巴细胞CTL杀伤靶细胞的颗粒外排途径和Fas-FasL途径联合杀伤靶细胞的过程CTL杀伤具有高度的抗原特异性及严格的MHC限制性CTL连续杀伤靶细胞

CTL的杀伤特点：抗原特异性、MHC限制性、高效性与连续性

方法1.形态学检测法

淋巴细胞与靶细胞按一定比例加在一起培养一定时间，染色后计数残留靶细胞（肿瘤细胞）数，计算淋巴细胞抑制肿瘤细胞生长的抑制率。对照组（不加LC，只有肿瘤细胞）：对照组平均残留肿瘤细胞数实验组（LC+肿瘤细胞）：实验组平均残留肿瘤细胞数抑制率%=对照组-实验组对照组100%2.同位素法：常用51Cr释放试验原理：用51Cr标记靶细胞（一般为肿瘤细胞），将它与待测淋巴细胞（效应CTL细胞）一起培养，效应细胞破坏靶细胞，51Cr释放出来，测定释放的51Cr数量，便可推知效应细胞的杀伤能力。方法：效应细胞：受检者外周血单个核细胞靶细胞：用铬酸钠（Na251Cr)标记传代肿瘤细胞分三组：1.最大释放组：50µl靶C+150µlDW(靶细胞全溶)2.自发释放组：50µl靶C+150µl培养液3.实验组：50µl靶C+150µl培养液+100µl效应C效：靶分别为100：1；50：1；25：1培养后取上清测cpm计算特异溶解百分率：实验组cpm-自发释放组cpm

最大释放组cpm-自发释放组cpm100%特异溶解百分率大于50%为阳性细胞免疫功能体内检测法（体内试验）

—Ⅳ型超敏反应皮试原理：Ⅳ型超敏反应的本质是细胞免疫，因此Ⅳ型超敏反应为阳性，可反映机体细胞免疫功能好。1.特异性抗原皮肤试验：所用Ag:OT或PPD以OT为例：OT1:20000.1ml皮内注射，48—72h观察结果，红肿硬结直径大于0.5cm为阳性

该试验设计是基于人群中96%的人均感染过结核菌（被结核抗原致敏），致敏淋巴细胞再次接触抗原（如OT)后，释放细胞因子，使局部产生以巨噬细胞、淋巴细胞浸润为主的炎症反应（表面为红肿硬结）。阳性（直径>0.5cm)：表明曾感染过结核菌，细胞免疫功能好阴性(直径<0.5cm)

：表明细胞免疫功能差或从未感染过结核菌强阳性（直径>2.5cm)：表明现处于结核的活动期

2.PHA皮肤试验：

将定量PHA注射到受试者前臂皮内，6~12h后出现红斑和硬结，24~48h达高峰，直径>15mm为阳性反应。

该法敏感性高，安全可靠。

三.B细胞数量的检测（一）B细胞表面识别抗原受体（BCR）（SmIg,SurfacemembraneIg)的检测1.SmIg是B细胞表面膜免疫球蛋白，存在于成熟B淋巴细胞膜上，为B细胞结构蛋白。类型为：IgM、IgD型。作用及意义：

a.是B细胞的表面标志

b.是B细胞识别抗原的受体

c.检测外周血淋巴细胞时，表面有SmIg者为B细胞，故可作为检测B细胞数量的方法。2.方法（常用免疫荧光法）（1）试剂：荧光标记的抗人IgM、IgD抗体（2）外周血淋巴细胞涂片，荧光抗体染色（3）观察：阳性细胞呈均染上荧光3.正常值：15%~25%（二）B细胞表面抗原的检测

B细胞表面特有的CD抗原有：CD19、CD20、CD21等。B细胞亚群：B1群（CD19+、CD5+）

B2群（CD19+、CD5-

）用抗CD21的单抗（免疫荧光法、酶免疫组化法）检测外周血淋巴细胞，阳性细胞为B淋巴细胞，约占总淋巴细胞的10%~15%。

四.B细胞功能的检测（一）血清中Ig的测定

检测人免疫球蛋白常用方法单向琼脂扩散实验、免疫比浊法正常值：IgG12g/L(7.6~16.6)

IgM1.3g/L(0.4~2.2)