临床免疫学检验：6 免疫酶技术

第八章酶免疫技术Enzymeimmunoassay，EIAP75概述：

70年代初在免疫荧光技术基础上建立。

较IF、RIA(radioimmunoassay)更优越,

具有敏感、安全、稳定、易观察结果等优点原理：

利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab反应特异性，同时又不影响酶的活性，结合在AgAb上的酶催化底物，生成有色产物，根据产物颜色深浅推测出待测物中相应物质（Ab、Ag)有无及含量多少。Ag+AbE

AgAbE+底物呈色反应免疫酶技术具有

特异性—Ag、Ab反应

敏感性—酶的高效催化作用常用的酶（一）选择酶的要求1.自然界存在广，易获得2.易纯化、性稳、活力高3.形成的酶结合物稳定，并保留酶、抗体或抗原的活性4.底物来源方便并易保存5.反应后有色产物能快速测定6.酶分子量不能太大，太大不易进入组织细胞内，影响组化染色定位（二）常用的酶辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶等

辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP)一种铁卟啉蛋白质，分子量4.4万，能进入细胞内酶活性强，酶结合物可长期保存最适pH为5.5左右

选用时注意酶纯度和活性纯度：RZ表示，反映酶含量与蛋白含量之比，最好要RZ值为3.0左右活性：每1mg酶中所具有的活性单位，应大于250u/mg

HRP的底物：邻苯二胺(OPD),四甲基联苯胺（TMB）反应体系中作为供氢体DH2+H2O2

D+2H2O供氢体受氢体有色产物

HRPOPD特点：

有色产物为黄色

空白对照接近无色

敏感度高，有致癌作用TMB特点：有色产物为蓝色

无致癌作用底物系统（包括供氢体、受氢体）

临用时配，配后避光保存酶免疫技术分类:酶免疫组织化学染色技术（免疫组化）---组织标本中抗原的定位检测酶免疫分析（酶联免疫吸附实验，Enzyme-Linkedimmunosorbent

assay,ELISA)---液体标本中抗原或抗体的定性、定量检测酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linkedimmunosorbentassay）

ELISA

一.原理：

将酶分子与Ab或Ag连接成一酶结合物（酶标记物），当它与固相载体中相应Ag或Ab相遇，形成酶标记的AgAb复合物，加入底物，酶催化底物，生成有色产物，根据颜色深浅可测出溶液中Ag或Ab的量。固相载体聚苯乙烯Ag或Ab吸附到固相载体上的过程,称为包被(酶免疫测定法)

实验中所需酶标抗体的制备方法同荧光抗体制备：纯化后的抗体+酶透析去除游离酶测定酶标抗体工作浓度试验中有关术语及试剂：

包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后，不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6CB

洗涤(wash)：PH7.2-7.4PBS

酶结合物

：酶标抗体或酶标抗原

终止液：2MH2SO4OPD：HRP催化后其有色产物为黄色，H2SO4终止后变为橙色（棕色）。TMB：HRP催化后其有色产物为蓝色，H2SO4终止后变为黄色二.方法类型和操作步骤（一）双抗体夹心法双抗体夹心法步骤：包被已知Ab

洗涤加待测标本（测Ag？）洗涤加酶标Ab

洗涤加底物加终止液观察结果双抗体夹心法的基本实验过程洗涤三次终止液

该法主要用于检测抗原包被的抗体与酶标抗体属同一种类抗体每检测一种抗原就需制备相应的酶标抗体，较麻烦（二）间接法测抗体步骤：包被已知Ag＋待测标本（测Ab？）

——反应一段时间后，洗涤——加酶标抗抗体（酶标羊抗人IgG）——洗涤——加底物——加终止液，观察结果。

该法主要用于测抗体酶标记一种抗抗体可以用于多种抗体的检测包被抗体加标本（抗原）加抗体加酶标抗抗体间接法测抗原（三）双位点一步法步骤：包被抗体A＋待测标本＋酶标抗体B——洗涤，＋底物——终止液，观察结果（检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位）

该法是一次性加入标本和酶标抗体，试验程序简单，提高了检测的特异性用于检测Ag,且Ag是具有至少2种抗原表位的多价抗原反应系统中固相Ab与酶标Ab的量相对于待测Ag是过量的，因此复合物的形成量与待测Ag含量成正比（在方法可检测范围内）（四）竞争法步骤：待测管：已知Ab包被＋待测标本（Ag？）——洗涤，＋酶标Ag——洗涤，＋底物——显色先加先加（五）应用亲和素和生物素的ELISA

亲和素(avidin)：糖蛋白，一分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合

生物素(biotin)：维生素H，可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定亲和素生物素生物素生物素生物素

亲和素—生物素在ELISA中使用：

三.ELISA结果的判定（一）肉眼判定

与阳性、阴性对照颜色比较：

结果判定2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性；3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性。1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性；（二）酶标光度仪检测A492值（吸光率）：比色法1.与阳性、阴性对照测定值比较2.P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0

为阴性

P:positive（待测吸光度值）

N:negative四.ELISA试验的影响因素（一）固相载体

常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸附Ag或Ab的能力强，一但吸附，不能被洗脱。

固相载体：酶标板（微量反应板，12×8；

可分软、硬板

一次性使用，不可回收酶标板要求：吸附性能好、空白值低、透明度高板批间、孔间性能相近（二）抗原、抗体Ag：需纯化Ab：需效价高、亲和力强、纯化（三）试验条件1.包被（coating)：一般用pH9.6CB(carbonatebuffer)，0.05M,有利于蛋白质吸附

包被浓度：0.1~100g/ml，一般常用10g/ml包被时间、温度：4℃过夜或37℃1-3h包被量：100ul封闭(blocking)：用1%~5%牛血清白蛋白或5%~20%小牛血清或脱脂牛奶缓冲液浸泡1~2小时2.抗原抗体反应的条件（1）微碱性有利于抗原抗体结合，故用pH7.4PBS(phosphatebuffersaline)洗涤（2）去污剂有利于AgAb形成，洗液中加0.05%Tween-20（3）Ag、Ab反应时间、温度：一般37℃、30~40min3.洗涤

采用PH7.2-7.4PBS洗涤，规一化；每次浸泡1min，拍干，共洗涤3~4次或每次浸泡30s，共洗涤5次4.酶促反应条件温度37℃

时间10minpH5.5

底物量一致5.排除干扰：多设对照ELISA试验应设对照应设对照

操作应得结果阳性对照

同标本一样颜色深

阴性对照

同标本一样颜色浅or无色酶结合物对照

加酶步加入无色底物对照

加底物步加入无色空白对照

只加终止液无色（以间接法为例，每孔均已包被Ag）

血清100ul酶标二抗100ul底物100ul终止液100ul待测待测标本血清+++阳性阳性对照血清+++阴性阴性对照血清+++酶结合物对照

PBS100ul+++底物对照

PBS100ulPBS100ul++空白对照PBS100ulPBS100ul

PBS100ul+五.ELISA试验优缺点优点:1.既可测抗原又可测抗体2.微量、定性、定量3.特异性、敏感性高4.操作简单,可不用特殊仪器缺点:1.影响因素多,多方把关2.偶有假阳性、假阴性六.膜载体的酶免疫测定（P115）（一）斑点酶免疫吸附试验Dot-ELISA特点:1.固相载体为硝酸纤维素膜2.酶促反应后在膜上形成有色沉淀物固相Ag（二）免疫印迹试验immunoblottingtest，IBT七.应用(包括所有标记技术)(一)病原体的诊断及研究1.病毒、细菌等传染病的诊断

(测抗原或抗体)2.病毒、细菌表面抗原的研究(二)某些疾病的诊断1.某些微量物质有关疾病的诊断2.肿瘤的诊断及定位3.自身抗体检测协助自身免疫病诊断4.寄生虫疾病的诊断等(三)免疫学方面的研究

T、B细胞的发生、演化、表面抗原改变等的研究(四)微量物质的检测

体内:微量蛋白质、激素、酶等抗原;药物、糖等半抗原工农业:微生物、微量物质等思考题：1.ELISA的原理、方法（以间接法测抗体和双抗夹心法为例）及影响因素。2.ELISA试验应设哪些对照，为什么？3.判断ELISA试验结果的方法。第九章化学发光免疫分析技术P89

化学发光免疫技术是将发光系统与免疫反应相结合，来检测抗原、或抗体的方法。化学发光免疫分析的类型一.化学发光酶免疫测定

试验前部分与ELISA一样，使用HRP或ALP来标记已知的Ab(或Ag)，与待测标本中相应的Ag(或Ab)反应后，经洗涤加入底物（发光剂），酶催化、分解底物发光，用仪器检测发光强度，判断结果。

如酶是HRP，常用底物是鲁米诺或其衍生物。二.直接化学发光免疫分析是用化学发光剂（吖啶酯等）作为标记物直接标记抗原或抗体，从而检测待测标本中相应抗体或抗原的免疫测定方法。第十一章胶体金免疫技术（P108）

胶体金又称金溶胶，是金盐(氯金酸）被还原（还原剂：柠檬酸钠）成原子金后形成的金颗粒悬液胶体金的特性：1.胶体金性质：颗粒稳定均匀，分散悬浮，1~100nm2.呈色性：颜色与颗粒大小有关

2~5nm