微生物学：17病毒感染的实验诊断

病毒感染的实验诊断

病毒性疾病实验诊断的一般原则：特异、敏感、快速和简便。首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒；然后根据可疑病毒生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，确定实验诊断的方法。目前病毒感染的检查主要依靠经典的方法和近来发展起来的分子生物学等方法。

病毒学检验病毒分离培养病原学诊断形态学检测分子生物学技术——病毒核酸补体结合试验中和试验血清学诊断血凝抑制试验间接免疫荧光检测酶联免疫吸附试验

一、标本采集与运送（一）标本的采集

要从临床标本中成功地分离出病毒，很大程度上取决于标本的恰当采样和处理，为了保证标本质量，应注意以下问题：

1．采样时间

尽可能在发病的初期，急性期或患者入院的当天进行，越早越好，最好在治疗之前。疾病后期体内产生免疫力，病毒量减少或消失。

2．标本种类的选择

根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒的种类，选择相应部位采取标本，处理标本时要考虑病毒的生物学特性。常见分离病毒标本的选择见教材。

（1）

心脏疾病

（2）

中枢神经系统感染

（3）

先天或新生儿感染

（4）

胃肠道疾病

（5）

呼吸道感染3.采集的基本注意事项1．合适的位置，避免附近的组织或分泌物的污染。2．最佳时间采集，血液标本应采集急性期和恢复期双份血清测定抗体滴度。3．采集量要充分。4．使用合适的采集工具。消毒的、防漏的标本容器。5．尽可能在使用抗病毒药物之前采集标本。6．恰当标记标本并填写检测申请单。写明标本来源。7．尽量缩短运输时间。8．注意防护

4．常见标本的采集方法

（1）血液：以无菌手续抽取抗凝血10ml，翻转几次。抗凝剂可选用100u/ml肝素钠或EDTA。为了血清学检查的需要，应抽取另一管5ml血液，不抗凝送检。

（2）脑脊液：以无菌手续抽取脑脊液1~2ml，置无菌试管内，在冰浴中立即送检。4℃可存放72h。eg。柯萨奇病毒，埃可病毒，肠道病毒，腮腺炎病毒。

（3）宫颈或阴道拭子采取病灶部位分泌物，将拭子置运送液中；如无病损部位，则清理宫颈口粘液，将拭子伸入宫颈约1cm停留5秒以上（顺时针旋转三圈）取出，置运送液中4℃冰浴立即送检。eg.HPV,CMV

（4）粪便标本取2~4g粪便标本在无菌的容器中，加8~10ml运送液立即送检。eg.腺病毒，肠道病毒，轮状病毒。（5）含漱液可用无菌生理盐水，让患者含漱几次取得，与运送液等量混合。eg.流感病毒，副流感病毒，鼻病毒，RSV（呼吸道合胞病毒）

（6）咽拭子：用生理盐水湿润的拭子采取咽喉部表面，置运送液中，注意避免唾液污染。eg.腺病毒，CMV，肠道病毒，HSV，流感病毒。（7）尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸入尿道4cm轻轻转动2~3次，以获得较多的上皮细胞，取出后置运送液中。eg.CMV，HSV（8）尸检标本：应在死亡后尽早采取，采集各种器官时要分开使用器械和容器。已用福尔马林或石蜡包埋的组织块，可以用做免疫组化，核酸杂交，PCR。

（二）标本的运送和保存

标本采集后注意无菌、冷冻、保湿、立即送检。分离培养病毒的标本要尽快送到实验室处理和接种。如不能及时送检，可在4℃冷藏数小时，如需较长时间保存则应置-70℃。放置在-20℃，病毒容易灭活，冻存液中需加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）等作保护，避免反复冻融使病毒灭活。

为了抑制细菌生长通常在病毒传送培养基（VTMEagle's液或Hanks液中加入小牛血清或牛血清白蛋白）中加入抗生素如青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml，为了抑制真菌的生长加入2.5μg/ml二性霉素B或40μg/ml制霉菌素。

二、病毒的分离与鉴定（金标准）（一）病毒分离和鉴定的一般程序

见书P327图23-3（二）病毒的分离病毒是专性细胞寄生，需要在活细胞或动物体内才能得到分离。选择何种动物或细胞来分离，应根据临床感染的症状和流行病学资料，推测可能的病毒种类，选择相对敏感的动物和细胞来分离标本中的病毒。细胞培养，鸡胚接种，动物接种

1.细胞培养（1）

概念

将人或动物离体的活组织或分散的活细胞，在实验室的试管或培养基中，模拟体内的生理条件使之生存和生长，称之为组织培养。（2）

类型

A器官培养：如气管、肠段。器官保存了原功能，用于分离某些有器官特异性的病毒。

B组织块培养：如肝组织块培养肝炎病毒。

C细胞培养（单层细胞培养）：现广泛使用的组织培养技术。（3D培养）

（3）细胞培养的种类和方法

根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同可分为三类：

a.原代和次代细胞培养

离体的新鲜组织或器官，机械处理

胰蛋白

洗涤

吹打酶消化

加入营养液单个细胞悬液

1-3次

细胞计数

、调整细胞浓度

分装在培养

生长

瓶内培养形成单层细胞，称为原代细胞培养。

胰酶，EDTA转种新的培养瓶形成单层细胞，称为次代细胞培养

Eg.人胚肾或猴肾细胞。敏感性高但来源困难。

b．

二倍体细胞株

原代细胞多次连续传代后仍保持二倍体染色体特性（即含23对染色体），称之为二倍体细胞。传代细胞寿命一般为40~50代，可在培养早期进行冰冻保存，减少传代次数，延长使用时间。大多数为人成纤维细胞,如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。c．传代细胞系

来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程的变异细胞。细胞增殖特征和染色体均类似于肿瘤细胞。不宜用于疫苗的制备，常用于病毒的分离和鉴定。

Eg：Hela细胞，Hep-2，Vero细胞。（4）细胞培养的特点

优点：A．来源广；B．不受机体免疫因素影响，个体差异小，敏感范围广；C．易于观察病变；D．可用于病毒的分离、鉴定、疫苗的制备；E．易管理，相对比较经济。

缺点：条件要求高，必须要有细胞培养的条件。

2.鸡胚接种

鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料。

（1）

常用接种部位和用途

38-39℃

新鲜受精卵

5-13天

卵黄囊接种（乙脑）羊膜腔接种（流感腮腺炎）尿囊腔接种（同上）绒毛尿囊膜（疱疹，痘类）卵壳气室尿囊绒毛尿囊膜卵黄囊卵白羊膜羊水囊

①

卵黄囊接种：流行性乙型脑炎病毒分离②羊水腔接种：流感病毒、副流感病毒的初次分离③尿囊腔接种：流感病毒、腺病毒、腮腺炎病毒分离④绒毛尿囊膜接种：痘病毒、疱疹病毒分离（痘疮）

（2）

鸡胚接种的特点

优点：A.鸡胚是一个整体，可有多种接种途径；B.可收获大量病毒；C.鸡胚本是无菌无病毒的，对接种病毒不产生抗体；D.来源广，操作简便。

缺点:

A.易感病毒较少，应用较局限；B.反复用鸡胚传代，病毒毒力可下降。

C.胚内可能污染细菌和病毒,母体抗体

3.动物接种

（1）

常用动物：小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等

（2）

接种途径：

呼吸道病毒：如流感病毒，滴鼻接种3周龄新生小鼠

肠道病毒：如柯萨奇病毒，腹腔接种乳鼠（一日龄）

乙肝病毒：静脉注射猩猩

嗜神经病毒：如乙脑病毒（用3周龄小鼠）、狂犬病毒（用家兔），颅内接种

（3）

接种后观察：

应每日至少两次，必要时每隔2~4小时观察一次。根据实验目的不同，观察不同的反应情况。

小鼠：食欲减退，活动迟缓，耸毛，震颤，麻痹，瘫痪，死亡。

（4）

动物接种特点

优点：A.可以按照不同途径分离鉴定病毒，可模拟人类感染途径

B.可用于疫苗的筛选、制备

C.可用于制备抗血清

D.操作简便，对环境要求低

缺点：A.可自然带毒或隐性感染，影响结果观察

B.存在个体差异

C.敏感病毒较少，或有些病毒感染后不出现明显症状，不宜观察

D.不经济，难管理

（三）病毒的鉴定

1.初步鉴定

根据临床症状、流行病学特点、标本来源、易感动物范围、细胞病变特征及生物学特性、理化性质，可初步确定病毒属于何科何属。

（1）

动物感染范围及潜伏期

病毒感染动物的范围、发病的潜伏期有差异。如柯萨奇B组病毒对新生乳鼠致病，对成年小鼠不致病；小鼠脑内接种乙脑病毒，潜伏期一般为4天，少于4天发病则可能为非乙脑病毒引起。

（2）对鸡胚的敏感性

不同病毒对鸡胚不同接种途径敏感性不同。

直接法：如观察绒毛尿囊膜是否有病灶

间接法：尿囊液、羊水做血凝抑制试验等

（3）

病毒在细胞培养中的表现

①

细胞代谢类型改变：细胞代谢产酸可导致培养液pH指示剂呈黄色，病毒增殖抑制了细胞代谢，使培养液不变色或变红。但腺病毒不抑制细胞代谢，反而促进糖酵解增加产酸。

②细胞形态学变化

由病毒增殖所引起的细胞变化称为细胞病变效应(cytopathiceffectCPE)。

A.细胞溶解，细胞培养瓶中出现空斑,如肠道病毒；

B.细胞融合形成多核巨细胞，如疱疹病毒；

C.细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，如腺病毒；

D.胞浆内或核内出现嗜酸性包涵体，如狂犬病毒：

E.不出现细胞病变现象。

③空斑或蚀斑（plaque）形成试验空斑是指在单层细胞中被病毒感染引起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。一般而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引起。不同的病毒引起的空斑形态和大小不同。可进行病毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可进行病毒的鉴定。

④干扰现象（Interference）一种病毒感染细胞后，可以干扰以后进入的病毒的增殖。利用此现象鉴定不引起形态学变化的病毒。如某些型别的鼻病毒能干扰以后进入的副流感Ⅰ型病毒的增殖，从而阻抑后者的红细胞吸附作用。

同种以及同株的病毒间，如流感病毒的自身干扰。异种病毒和无亲缘关系的病毒之间也可以干扰，且比较常见。1.诱导产生干扰素（interferon，IFN）2.破坏了宿主细胞的表面受体或者改变了宿主细胞的代谢途径3.阻止第二种mRNA的转译

⑤红细胞吸附（HAd）及吸附抑制试验红细胞吸附现象的产生是由于病毒在细胞膜成熟时，将其血凝素插入细胞膜，使感染细胞吸附红细胞，是病毒增殖的指标。该现象可被相应的病毒特异性抗体所抑制，称为红细胞吸附抑制试验，可用来鉴定病毒。

（4）

理化性质的测定

①病毒的大小和形态：可用电镜观察病毒的大小和形态。②核酸类型鉴别及序列测定：利用5-溴-2-脱氧尿苷（BUDR）抑制DNA复制的特性，在细胞培养液中加入该物质，可抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细胞病变的出现，但对RNA病毒无抑制作用，以此判断病毒核酸类型。也可对病毒特异序列或全序列的碱基排列测定或DNA杂交、DNA-RNA杂交来鉴定病毒。

③耐酸试验

肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。

④乙醚敏感试验

病毒外周如有类脂包膜，则易被乙醚破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可作为病毒是否具有类脂包膜的依据，也可用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。

2.最后鉴定——血清学试验

在初步鉴定的基础上，对已分离出阳性结果需选择适当的血清学方法对病毒分离株作最后鉴定。血清学方法鉴定是将分离到的病毒和已知病毒的参考血清作中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等。由于分子病毒学的发展，病毒的最后鉴定还应包括分子生物学方法的鉴定，它还能检出不产生细胞病变的那些病毒。

（1）中和试验是将病毒与特异性抗体进行免疫反应，使病毒失去感染性，在细胞培养和活的机体内不出现病变的试验。常用细胞培养进行中和试验。方法：①固定病毒（100TCID50），稀释血清，测Ab效价。两次效价相差4倍以上有诊断意义。TCID50：50%组织细胞感染的病毒剂量(50%Tissuecellinfectivedose

TCID50)。②固定血清（1：20或1：40），稀释病毒，求中和指数。固定病毒本法用以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液（与血清混合后，每一接种剂量含病毒100LD50），摇匀后，置37℃作用1h，接种实验动物固定血清本法多将病毒作10倍递增稀释，分置2列试管，第一列加正常血清（对照组），第二列加待检血清（试验组）。混合后，置37℃作用1h，将各管混合液分别接种选定的试验动物，每一稀释度用3～5只动物。接种后，逐日观察，并记录其死亡数，观察结束后，计算LD50和中和指数。空斑减少法在细胞培养上进行病毒中和试验，近年来多采用空斑减少法。先将病毒稀释成适当浓度，使每0.2ml含80个～100个PFU（空斑形成单位），与不同稀释度的待检血清等量混合，置37℃作用1h～2h，分别测定PFU，使空斑减少50％血清稀释度即为该血清的中和价

中和指数>50为阳性，有意义；中和指数<9为阴性，无意义；中和指数10~49，为可凝。

中和指数：实验组/对照组比值中和试验较复杂和费时，多用于V的鉴定和流行病学调查，对临床诊断价值不大。（2）血凝与血凝抑制试验某些病毒可与一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞产生血凝现象。加入相应的血凝素抗体可抑制血凝现象的发生，称为血凝抑制试验。可作为病毒型别鉴定的依据。（3）补体结合试验

三、病毒感染的快速诊断（一）、病毒的形态学检查

1.

光学显微镜

可以观察到大型的病毒如痘病毒类。在光学显微镜下还可以观察到病毒感染的宿主细胞的胞质内或细胞核内出现嗜酸性的包涵体（inclusionbody）。根据包涵体的特点，可以作出辅助诊断。包涵体可能是病毒增殖的场所或病毒颗粒的聚合体，也可能是宿主细胞对病毒作用的反应产物，一般来说，产生核内包涵体的是在细胞核内装配的病毒（通常为DNA病毒），产生胞质内包涵体的是在胞质中装配病毒（通常为RNA病毒）。

2.

电子显微镜检查（1）电镜直接检查：某些病毒感染的早期在临床标本中就可出现病毒颗粒。经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染，电镜下直接观察，可发现病毒颗粒，获得诊断。（2）免疫电镜检查：在含病毒的标本中，加入特异抗体。经抗原抗体反应后，使标本中的病毒颗粒聚集成块，再经负染观察，比直接电镜检查更易发现病毒体，灵敏度可提高100倍。（二）、病毒抗原检查病毒抗原是病毒特异性的标志，通过免疫学技术检测标本中的特异性抗原存在，可以早期诊断病毒感染。用于病毒抗原检查的抗体，最好是单克隆抗体。

1.

免疫荧光技术

有直接和间接荧光法。具有快速、实用的优点。适合于病毒型别少，细胞培养难以成功的病毒。间接荧光技术具有放大作用，因而灵敏度比直接法高。免疫荧光技术易出现非特异性荧光，导致假阳性，需要严格对照和排除试验。

2.

酶免疫技术有酶免组化和酶免吸附试验法。酶免组化法与免疫荧光技术相同，不同的是将荧光标记改为酶标记。由于酶反应的产物具有累积性，因而灵敏度比荧光技术高。

3.其它技术

如固相放射免疫技术、发光免疫分析技术、胶体金标记的免疫层析技术等。

（三）抗体检测检测病毒感染机体后产生的早期特异性抗体。

1.

斑点杂交法(dotblothybridization)：

将待测的DNA或RNA直接点在杂交滤膜上,变性后,用标记的核酸探针进行杂交。

（四）、病毒核酸检测

2.

固相杂交技术将核酸探针进行修饰后，包被强力吸附的聚苯乙烯微孔板中，加入待测的核酸序列和标记的指示探针在微孔板的杂交液中，进行杂交，洗涤后，用酶免疫技术进行检测。或将核酸探针包被于微小磁珠表面，悬浮于杂交液中。与待测的核酸序列及标记的指示探针进行杂交。用磁分离技术分离结合有杂交体的磁体，进行检测。

3.原位分子杂交技术（insituhybridization），FISH

是核酸杂交技术结合细胞学技术的一种特殊检测技术。通过将细胞固定后，在不破坏细胞结构的前提下，在细胞原位释放暴露DNA或RNA，加入标记的特异核酸探针，进行杂交。通过显色技术，可以显示特定的杂交探针在细胞内的位置和核酸的数量。直接观察待测核酸在细胞内的分布状态与细胞染色体的关系。

4.Southern印迹法和Northern印迹法：

Southern印迹法用于DNA的杂交。将DNA提取后，直接或经限制性内切酶切割后，在琼脂糖电泳中使DNA按分子量大小分开，然后将琼脂糖凝胶中的DNA移至硝酸纤维膜上，用标记探针进行杂交。可以检测病毒DNA中的特异序列。

Northern印迹法用于RNA的杂交分析。利用RNA与DBM(diagobenloxymethyl)结合的特点，将琼脂糖电泳后的RNA移至DBM膜上，用标记探针进行杂交。RNA也可转移至硝酸纤维膜上进行杂交分析。用于检测RNA或mRNA。

5.聚合酶链反应(polymerasechainreactionPCR)：选择病毒的特异、保守片段作为靶基因，进行引物设计和扩增，可诊断病毒性感染。选择病毒的易变区，结合RFLP，测序等技术可以对病毒进行分析和突变的研究。（1）

DNA病毒：可直接进行PCR扩增其特异片段。（2）

RNA病毒：可通过RT-PCR技术，将RNA逆转录为cDNA，再进行PCR扩增，常结合巢式PCR(nest-PCR)技术进行二次扩增，提高了反应的灵敏度和特异性。（3）

定量PCR技术：PCR技术是以指数方式对靶基因进行扩增。采用内标准对扩增的产物进行原始标本定量，对病毒感染的诊断起到了量化的作用。同时，对研究病毒和机体之间的关系提供了参考。

6.

病毒核酸的直接检测有些病毒如轮状病毒的核酸具有典型的分节段特点。可以从标本中直接提取轮状病毒的核酸。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），观察其特有的11个核酸