临床免疫学检验：8 Ig分纯

抗血清（Ig)的分离提纯P24

目的有利于标记减少非特异性反应有利于Ig定量分离提纯方法盐析法(P20)（一）原理在不同浓度的中性盐中蛋白质会脱水，降低带电电势，由亲水胶体变为疏水胶体，分子间相互凝聚而沉淀（盐析作用）。不同蛋白质盐析所需中性盐的浓度不同，故可分离不同蛋白质。亲水胶体分离蛋白质所用硫酸胺的浓度纤维蛋白原20%饱和度球蛋白、部分、33%饱和度球蛋白白蛋白

>50%饱和度

｛（二）常用的中性盐：硫酸胺硫酸胺盐析的优点溶解度大（饱和700~800g/1000ml)溶解度受温度影响小蛋白质不易变性操作简便缺点1.需除去NH4+，透析时间长2.含氮，干扰蛋白质定量3.不纯的硫酸胺含有金属，可与蛋白质结合，因此硫酸胺需用分析纯试剂（三）方法：1.配制饱和硫酸胺溶液2.加入稀释血清3.透析去除NH4+(奈氏试剂检测）稀释血清磁块磁力搅拌器硫酸胺盐析示意图

1.计算并加入所需的硫酸胺量（ml）

2.搅拌过程中缓慢加入稀释血清注意点：pH

硫酸胺pH应接近蛋白质的等电点，才易形成沉淀（Ig

的pI=7.3~8.2，pH应7.7左右）蛋白质浓度

2.5~3%为宜，所以血清要稀释温度室温即可（除特殊要求者）二.离子交换层析法

(P20)

原理利用不同的蛋白质在缓冲溶液中所带电荷不同，与某一载体上的具有相反电荷的离子基团进行吸附，然后进行解脱，达到纯化蛋白质目的。常用载体是纤维素（DEAE）

例如在PH6.5的醋酸缓冲液中，侵泡DEAE，使DEAE带正电，因此它能吸附带负电的Alb、α、β球蛋白（其PI均<6，PH6.5＞PI，带负电），仅γ球蛋白PI为7.3，带正电（PH6.5<PI，带正电）不能被DEAE吸附而直接流出，此时收集的第一峰即为提纯的γ球蛋白。然后通过改变缓冲液PH和离子强度，使Alb、α、β依次洗脱下来。方法：1.用酸处理载体二乙氨乙基纤维素（DEAE），使其带正电荷2.装柱3.加入蛋白质溶液，过柱时带负电的蛋白质吸附于载体上，带正电的蛋白质流出4.然后用碱性溶液洗脱离子交换层析先将处理后的纤维素装柱，再从上加入要分离的蛋白质溶液。当蛋白质溶液全部进入纤维素柱中后，改变缓冲液pH，进行洗脱。三.凝胶过滤（层析）法（P20）原理：

凝胶颗粒是网格状结构，当分子大小不同的混合物流经凝胶柱时，大分子蛋白质不易进入凝胶网格，只能分布于凝胶颗粒间，因此在洗脱时向下移动速度快，最先被洗脱下来；小分子蛋白质则嵌入凝胶颗粒的网状结构中，洗脱时向下移动速度慢，较晚被洗脱，从而将分子大小不同的物质分离，即为分子筛的作用。常用凝胶：葡聚糖凝胶Sephadex聚丙烯酰胺凝胶Sephacryl琼脂糖凝胶Sepharose常用葡聚糖凝胶Sephadex的型号型号：G10、25、50、75、100、150、200蛋白质孔径愈小，选用型号愈小不同型号分离蛋白质大小不同，分离Ig

多用G150方法：1.用缓冲液浸泡凝胶干粉，使其充分膨胀2.装柱3.蛋白质溶液过柱，收集过柱后的蛋白质溶液，一般5ml/小时凝胶过滤层析缓冲液持续冲洗凝胶装柱凝胶过滤分离的优点：1.使用单一缓冲液，不需梯度洗脱2.重复性好，样品回收率高3.不引起蛋白质变性和失去生物学活性缺点：1.凝胶网格孔径大小有限，限制分离物2.凝胶可吸附芳香类、脂蛋白等物质，影响分离效果3.过滤速度慢（5ml/h），上样后要走1-2天四.亲和层析法（P20)原理：

利用抗原抗体的结合具有特异性、可逆性，将纯化抗原先交联到载体上，制成亲和层析柱，当Ab（Ig）通过时，与抗原在柱上特异性结合，Ab中杂质流出。然后通过改变缓冲液pH、离子强度，使Ab解脱下来。方法：1.亲和层析柱制备

Sepharose4B

吸附特异Ag

装柱2.蛋白质溶液过柱（特异性Ag与相应Ab结合）3.改变缓冲液pH冲洗柱子，使Ag、Ab分离，收集Ab溴化氰优点：

分离的Ig很