生物化学：2蛋白质的分离纯化

蛋白质分离纯化及蛋白质测定方法及评价一、蛋白质分离纯化方法研究蛋白质或酶的物理及化学性质,首先需进行纯化

若要研究蛋白质或酶的主体结构及酶的活性中心,催化反应机理等,则还需清除最后残留在分子中的微量其它蛋白和大分子化合物分离蛋白质及酶类要顾及最大的生产量要顾及最大的催化活性要使蛋白及酶纯度尽可能达到最高1.蛋白质分离纯化的技术路线设计及条件蛋白质的分离纯化不可能有一个固定的程序适用于各种蛋白质的分离制备工作。蛋白质分离纯化的总目标是增加制品的纯度（purity）或比活（specificactivity）蛋白质分离要点:1.争取时间2.能简则简亲和层析电泳分离蛋白纯品精分离粗分离前处理凝胶层析生物体组织细胞离心分离盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法蛋白质粗制品蛋白质粗抽提液组织粉碎细胞裂解蛋白释放DNA释放离子交换层析

蛋白质分离纯化的一般技术路线2、材料的选择及预处理分离纯化蛋白质应先考虑选择适当的材料。选材要依据研究、诊断的目的及遵循以下原则：一所含靶蛋白量高；二材料易得。进行预处理：剔除不必要的结缔组织、脂肪组织等；取出的组织和器官要迅速处理；精制某些易在体内被分解的活性蛋白质、酶或蛋白激素时，一般易用新鲜材料；培养的细胞中分离纯化时，充分洗涤，离心收集细胞。3、细胞破碎的方法除了体液、细胞外某些靶蛋白不需要破碎细胞外，对于胞内及多细胞生物组织中各种蛋白质的分离纯化均需粉碎组织、裂解细胞，使蛋白质充分释放至裂解液中。各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法应用Ⅰ机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母Ⅱ物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞Ⅲ化学法1有机溶剂细菌、酵母2表面活性剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母材料的预处理及细胞破碎

使蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态及活性。常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法：利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。2.渗透破碎法：在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3.反复冻融法：生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。4.超声波法：使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5.酶法：如用溶菌酶破坏微生物细胞等。四、蛋白质的分离纯化方法分离纯化的方法一般有：①以溶解度的差异为依据的方法：盐析、分配层析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀和结晶等；②以分子大小及形状差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤层析等；③以电离性质差异为依据的方法：电泳、离子交换层析等；④以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析。分子大小：

透析、超滤、离心、凝胶过滤分子形状：离心，过滤主要技术溶解度：

等电点沉淀、盐溶和盐析、有机溶剂、温度电荷：

电泳、离子交换层析主要技术密度：离心亲和力：

亲和介质稳定性：热稳定性、蛋白酶解稳定性分配系数：双水相萃取分离蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂质分离开来。常用的有下列几种方法：

1.等电点沉淀法

2.盐析法

3.有机溶剂沉淀法样品的进一步分离纯化

凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。

有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。4.蛋白质的质量鉴定

1、纯度鉴定

2、活性鉴定3、浓度鉴定蛋白质样品的纯度鉴定蛋白质的纯度（purity）：指是不含有其它杂蛋白，但不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内。目前常用的鉴定纯度的方法有：有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS、毛细管电泳（CE）、等电聚焦电泳（IFE）及高效液相色谱（HPLC）。只用一种方法鉴定蛋白质的纯度是不够的，至少应用两种以上的方法，而且是两种分离原理不同的方法，来判断蛋白质的纯度才比较可靠。最终的纯度标准，唯一的氨基酸顺序蛋白质的活性定量测定蛋白质混合物中某一特定靶蛋白的含量通常要用具有高度特异性的生物学方法。活性的测定和总蛋白量的测定配合起来可以用来表示分离纯化过程中某一特定靶蛋白的纯化程度。纯化程度常用这一特定成分的含量（一般用活力单位）与总蛋白量（质量单位）之比来表示。定量蛋白质有如下假定所有蛋白质都是单纯的多肽链，糖脂类及金属有机物等均不计在内，其含氮量平均为16%各种蛋白质理化性质虽不一样，但与化学试剂的反应一致采用哪一种方法，一般考虑的是准确性、操作方便、影响因素少。二、蛋白质定量检测方法蛋白质测定的基础蛋白质含氮量16%重复的肽键结构蛋白质中所含的酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外吸收与色素的结合能力沉淀后的浊度或光折射改变（上述原理不但适合于总蛋白质的测定，也可用于分离出来的蛋白质组分的测定）临床检验中测定蛋白质的几种情况测定血清（浆）总蛋白蛋白质电泳以获取各类蛋白质所占比例测定个别蛋白质蛋白质测定一般需要一个已知蛋白浓度的标准品来绘制标准曲线或作为标准管与样品同时测定。凯氏定氮法测定蛋白质最古老方法当今蛋白质标准定值方法由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量凯氏定氮法

高温,浓酸OH-蛋白质（N）——NH4＋——NH3——硼酸吸收——用酸碱滴定或纳氏试剂测定氮含量——按6.25g蛋白质/1g氮计算蛋白质含量

凯氏定氮法样品消化：消化反应方程式如下2NH3（CH2）2COOH+13H2SO4

（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：2NaOH+（NH4）2SO4

2NH3↑+Na2SO4+2H2O吸收与滴定：加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定2NH3+4H3BO3

（NH4）2B4O7+5H2O（NH4）2B4O7+5H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3

凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织、器官及食品等组成复杂样品的测定，但操作比较复杂，含大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果往往偏高，其他含氮物质对测定结果有干扰.

该法灵敏，准确，是目前建立各个具体方法时采用的参考标准方法。双缩脲法（Biuret）临床上首先推荐的蛋白质定量蛋白质中的肽键（－CONH－）在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物。此反应同两个尿素分子缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应形似，故称为“双缩脲反应”至少含有两个－CONH－基团才能反应，故二肽以上才有上述现象蛋白质和多肽中的肽键在碱性溶液中与铜离子共热，生成紫红色的络合物。显色强度和蛋白浓度成正比。O=CC=ONHHNR-CHCH-RO=CC=ONHHNR-CHCH-RCu2+标本采集病人准备：无特殊要求。最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。类型：血清或血浆。标本存放20～25℃保存可稳定6天；4～8℃保存可稳定4周；-20℃保存至少可稳定1年。标本运输室温条件下运输参考值范围[g/L]成人：60～80儿童/青少年男女1～30天42～62

41～631～6个月44～66

47～676个月～1岁56～79

55～701～18岁57～80

57～80（注：各实验室应有自己的参考范围。）参考值因性别、年龄、饮食和地域的不同而有所差别。根据好的实验室经验，每个实验室应建立自己的参考值。操作简单快速，重复性好，干扰物质少，不同蛋白质之间影响小。清、球蛋白产生的颜色反应相近；适于自动化分析，线形范围：0.5--150g/L灵敏度较低100ug/ml精密度：批内重复性小于3%，总不精密度小于3%。检测限：0.5g/L干扰物质：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。静脉滴注大量右旋糖酐的病人血清或血浆，使用双缩脲方法的检测结果会明显增高；

主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要非常精确的蛋白质测定。

Folin-酚试剂法

（Lowry法）是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，同时蛋白质中存在的酪氨酸与色氨酸同磷钼酸-磷钨酸试剂反应后生成蓝色化合酸。蛋白质与福林（Folin）-酚试剂反应，产生蓝色复合物，呈色强度与蛋白质含量成正比。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入Folin—酚试剂，以增加显色量，提高了检测蛋白质的灵敏度。本法灵敏，受多种还原性物质干扰，不同蛋白质之间差异大Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。优点:灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多缺点:费时，需精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。注意:进行测定时，加Folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

干扰物质：

双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。容易受到非蛋白物质的影响；含EDT

A，Tritonx-100，ammoniasulfate等物质的蛋白不适合此种方法。操作简单，重复性好，无需昂贵设备，适于一般实验室使用。灵敏度：1ug/ml此法可检测的最低蛋白质量达5mg。测定范围是20~250mg。

干扰物质多，反应速度慢，不同蛋白质间差异大，准确性差。染料结合法

（dyeconjugation）酸性环境中蛋白质分子可解离出带有正电荷的-NH3+基团，它可与阴离子的染料产生颜色反应，与同样处理的标准溶液比较即可求得样品中蛋白质的含量染料有CBBG-250、氨基黑、丽春红、邻苯三酚红－钼酸钠、银、胶体金等考马斯亮蓝G-250染料结合法血清总蛋白测定最常用的染料是考马斯亮蓝G-250（CBBG-250），即Bradford法染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值A595，在酸性条件下，CBBG-250与蛋白质结合后由棕红色变为蓝色，反应迅速而稳定，最大光吸收从465nm移至595nm,呈色与蛋白质浓度成正比。

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

优点：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

（3）干扰物质少。

缺点：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

（2）干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。

本法简便快速，重复性好，灵敏度高，但特异性不高，MW大于3000的多肽也参与反应，强碱和去垢剂会影响呈色，清、球蛋白呈色强度不同。紫外吸收法紫外吸收法蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基含有共轭双键，在280nm处有吸收峰蛋白质中肽键在220-238nm左右存在光吸收应用：总蛋白含量测定与核酸鉴别：生物样品中常混有核酸，其最大吸收峰在260nm，因此可进行鉴别1．A280nm光吸收法原理:蛋白质的芳香环残基在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用。在（280mm波长下，光吸收程度与蛋白质浓度（3～８mg／mL）成直线关系，因此，通过测定蛋白质溶液的吸光度，并参照事先用凯氏定氮法测定蛋白质含量的标准样所作的标准曲线，即可求出样品蛋白质含量。本法操作简便迅速2．A260nm和A280nm比值法原理凡是有共轭双键的物质，均具有紫外吸收值。因此，若样品中含核酸，则嘌呤、嘧啶两类碱基对蛋白质的测定产生干扰，应加以校正。核酸在260nm处的紫外吸收值大于280nm处的紫外吸收值，但蛋白质恰恰相反。由于不同的蛋白质和核酸对紫外吸收不同，校正后的测定结果还存在一定的误差。Lowry－kaleker公式

蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280-0.74A260Warburg－Christian公式

蛋白质浓度(mg/ml)=1.55A280-0.76A260Waddell公式

蛋白质浓度(mg/ml)=144×

（A215-A225）核酸对测定蛋白质浓度的干扰较正公式3．A215nm和A225nm的吸收差法原理对于蛋白质的稀溶液，由于蛋白质含量低而不能使用280nm的光吸收测定，可用215nm和225nm吸收值之差求算蛋白质浓度。方法分别测定样品A215nm和A225nm，并求出差值，与蛋白质标准溶液吸收差值作对照，求出样品的蛋白质含量。

本法在20～100mg/L蛋白质范围内呈良好线性关系。4．肽键紫外光测定法原理蛋白质溶液在238nm下均有光吸收，其吸收强弱与肽键多少成正比，根据这一性质，可测定样品在238nm下的吸收值，与蛋白质标准液作对照，求出蛋白质含量。本法比280nm吸收法灵敏紫外吸收法简便快速，样本可回收再利用，但仪器昂贵，不同蛋白质之间差异大（法1-2），且游离酪氨酸、色氨酸、尿酸和胆红素等也存在紫外光吸收。临床上极少用于体液蛋白质含量的测定？几种方法的比较方法灵敏度化学干扰不同蛋白质间差异快速性与复杂性双缩脲100μg中等小快速简易

福林-酚1μg严重大较复杂CBBG-2501μg低大快速简单紫外分光光度法10μg较严重大快速简单比浊法

（turbiditymethod）某些强酸（三氯醋酸、磺基水杨酸等）能与生物碱结合而沉淀，称为生物碱试剂。它们可与蛋白质结合产生细微沉淀，通过比浊求得蛋白质含量在酸性溶液中蛋白质带有正电荷，可与带负电荷的生物碱试剂结合形成细微沉淀，经测定悬浮液的浊度，与同样处理的蛋白质标准品比较，即可求得样品中蛋白质的含量此法操作简便，试剂易得，但浊度强弱受多种因素影响折光测定法

（ratioofrefraction）溶解在溶液中的固体可以增加溶液的光折射，通过测定血清的折射指数可以计算出总固体的含量由于每升正常血清中含有约16g非蛋白固体，它们对折射指数的影响必须进行校正折射率＝1.3353＋蛋白质浓度（g/dl）×

0.00191此法准确性较差，且清、球蛋白的折射率不同OPA荧光法OPA：o-phthalaldehyde,o-苯二醛在巯基乙醇存在条件下，OPA与主胺发生反应生成一种具有强烈蓝色荧光的物质，其最大激发波长为340nm，发射波长为455nm。本法灵敏度高，线性范围广白蛋白（Albumin）测定白蛋白是血清中含量最多的蛋白质将清、球蛋白分离后测定：盐析法不分离清、球蛋白直接测定：染料结合法染料结合法测定白蛋白含量白蛋白能通过离子键或疏水键结合低分子物质（包括生理性代谢物和外源性物质）能力强，故可不分离清、球蛋白直接测定染料多用溴甲酚绿（BCG）、溴甲酚紫（BCP）药物（青霉素等）、胆色素等能与染料竞争结合白蛋白，故可干扰测定结果灵敏度高，操作简便，重复性好溴甲酚绿（BCG）法测定白蛋白BCG:bromcresolgreen,一种阴离子染料,全称:3,3’,5,5’-四溴-间-甲酚磺酞在pH4.2及非离子去垢剂Brij-35存在条件下，BCG可与白蛋白紧密结合形成兰绿色复合物，于630nm处有强的光吸收BCG与白蛋白的复合物会发生部分沉淀，且BCG的特异性较差，能与球蛋白反应，但呈色强度较弱，同时反应速度较慢标本采集：病人：无特殊要求。最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。血清、肝素或EDTA血浆。标本存放：留取标本后请尽快分离血清/血浆。在室温条件下（15～25℃）可以稳定一周，在冰箱保存的条件下（2～8℃）稳定一个月，-20℃保存至少可以稳定3个月。线性范围2～60g/L

精密度：小于3%重复性：AU1000批内重复性小于3%，总不精密度。灵敏度：2g/L。干扰：当样品中抗坏血酸浓度1704mol/L，胆红素浓度684mol/L，血红蛋白浓度

4.00g/L，甘油三酯浓度5.63mmol/L时没有观察到干扰。溴甲酚紫（BCP）法测定白蛋白化学结构与BCG相似在pH5.2及brij-35存在条件下，可与白蛋白形成紫色复合物，于603nm处有光吸收BCP与白蛋白的反应是即时完全反应BCP与白蛋白反应特异性高，与血清非蛋白成分反应微弱，干扰小球蛋白测定临床检验中多用总蛋白与白蛋白之差计算乙醛酸直接测定：在酸性溶液中，蛋白质的色氨酸残基与乙醛酸反应，产生紫色化合物，称Hopkins-Cole反应，可于540nm比色，球蛋白中色氨酸约2％～3％，而白蛋白仅0.2％白蛋白与球蛋白比值（A/G比值）：

衡量肝脏疾病的严重程度

正常值：1.5-2.5:1<1,比值倒置，为慢性肝炎或肝硬化的特征之一That’sallThankyou！透析法：根据分子量的大小，用透析袋将大、小分子物质分开。去除溶液中的盐分、有机溶剂、小分子抑制剂、过剩的反应物、底物等最常见、最方便的方法。超滤法：利用高压力或离心力，使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。离心：蛋白质在离心通过溶液运动时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到形状的影响

凝胶过滤：根据被分离物质的分子大小不同来进行分离.等电点沉淀：蛋白质在等电点时其溶解度、导电性、粘度、渗透压最小，且较不易溶解。+++++++带正电荷的蛋白质－－