实验酶切连接及电泳检测

实验酶切连接及电泳检测第一页，共四十五页，2022年，8月28日

质粒在正常情况下以共价闭合环状cccDNA构型(超螺旋scDNA)存在，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状/超螺旋DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA）；线形DNA(LDNA)质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图关于电泳条带第二页，共四十五页，2022年，8月28日质粒DNA的带型分析MpUC19环形质粒DNA超螺旋粒DNA第三页，共四十五页，2022年，8月28日出现问题电泳条带浓度和纯度电泳条带拖尾现象（加样过多，离子浓度，胶未完全凝固）质粒DNA的带型分析第四页，共四十五页，2022年，8月28日实验六

DNA的酶切、连接及电泳检测第五页，共四十五页，2022年，8月28日实验步骤（一）质粒DNA酶切(注：每人一管）在200μl的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl）↓混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。↓反应结束后，75℃，保温10min使酶失活。↓电泳检测

样品代号成份

反应1（标准pUC19)ddH2O无菌水(μl)7pUC19质粒(μl)1010*H酶切缓冲液(μl)2EEcoRI酶(μl)1.0Total(μl)20第六页，共四十五页，2022年，8月28日酶切样品代号成份

反应（标准pUC19)ddH2O无菌水(μl)7pUC19质粒(μl)1010*H酶切缓冲液(μl)2EEcoRI酶(μl)1.0Total(μl)20第七页，共四十五页，2022年，8月28日（二）DNA片段的连接(注：每人一管）取200μl的离心管按下表加入试剂。↓混匀后点动离心，将溶液甩至管底↓置于已调好温度为12℃-16℃PCR仪中↓保温1-2h后取出↓电泳检测样品代号成分用量（μl）ddH2OddH2O7.0T14λDNA/EcoT14I片段10.010*T4连接缓冲液2.0T4T4DNA连接酶1.0总体积20第八页，共四十五页，2022年，8月28日连接样品代号成分用量（μl）HddH2O7.0T14λDNA/EcoT14I片段10.0Buffer连接缓冲液2.0T4T4DNA连接酶1.0总体积20第九页，共四十五页，2022年，8月28日（三）质粒酶切样品和DNA连接样品的电泳检测琼脂糖凝胶的制备：制备2块0.7%（0.28g/40ml）和2块1.2%琼脂糖凝胶（0.48g/40ml）。（注：全班制备4块胶）第十页，共四十五页，2022年，8月28日1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立；2、了解影响酶切的因素；3、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立；4、了解影响连接反应的因素。实验目的第十一页，共四十五页，2022年，8月28日通过DNA重组技术构建DNA重组子

利用限制性核酸内切酶切割DNA+利用DNA连接酶连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行表达提供了有效的实验材料。第十二页，共四十五页，2022年，8月28日限制性内切酶的发现1965年WernerArber第一个描述了限制性内切现象；HamiltonO.Smith第一个纯化了限制性内切酶，并鉴定了其性质；DanielNathans用这些酶将SV40病毒的DNA切割成了特定的片段，并绘制了SV40病毒基因组的“物理图谱”。1978年这三人获得了当年的Nobel奖。ArberW.SmithH.O.NathansD.第十三页，共四十五页，2022年，8月28日第一个DNA重组分子1972年PaulBerg等人利用限制性内切酶EcoRI和连接酶获得了第一个DNA重组分子。标志着遗传工程的开始。TheNobelPrizeinChemistry1980

PaulBerg第十四页，共四十五页，2022年，8月28日通过DNA重组技术构建DNA重组子酶切连接第十五页，共四十五页，2022年，8月28日实验原理–

酶切

限制性内切酶（restrictionendonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。

限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。

第十六页，共四十五页，2022年，8月28日生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。第十七页，共四十五页，2022年，8月28日

根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型切割位点则在下游24-26bp处。Ⅰ类需Mg2+、SAM及ATP识别位点复杂，特异性差，切割位点距识别点远。Ⅱ类仅需Mg2+识别切割特异性强，切割发生在识别位点。Ⅲ类需Mg2+及ATP切割位点在识别位点周围，酶活性不单一。第十八页，共四十五页，2022年，8月28日命名一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性内切酶称为BamH，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboII等。第十九页，共四十五页，2022年，8月28日II型限制性内切酶主要特点：识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶。II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端和平头末端。如:EcoRI的识别顺序为：

5’……GAATTC……3’

3’…….CTTAAG……5’回文结构的对称轴第二十页，共四十五页，2022年，8月28日

限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位（1Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。

影响酶切的因素：在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切(星号活性)。图:构建DNA重组子第二十一页，共四十五页，2022年，8月28日材料、试剂及器具1、材料与试剂酶切反应：标准pUC19(2686bp)EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液检测：0.5×TBE电泳缓冲液6×电泳载样缓冲液、Goldview、琼脂糖第二十二页，共四十五页，2022年，8月28日2、器具：水平式电泳装置电泳仪,台式高速离心机恒温水浴锅（用PCR仪代理）微量移液枪微波炉或电炉紫外透射仪照相机及其附件第二十三页，共四十五页，2022年，8月28日实验步骤（一）质粒DNA酶切(注：每人一管）在200μl的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl）↓混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。↓反应结束后，75℃，保温10min使酶失活。↓电泳检测

样品代号成份

反应1（标准pUC19)无菌水(μl)2P质粒(μl)6H酶切缓冲液(μl)1EEcoRI酶(μl)1.0Total(μl)10第二十四页，共四十五页，2022年，8月28日（三）质粒酶切样品、DNA连接样品的电泳检测琼脂糖凝胶的制备：制备2块0.7%（0.28g/40ml)第二十五页，共四十五页，2022年，8月28日（四）加样及电泳检测1、酶切样品的检测酶切阴性对照（M1）：pUC19标样20μl+6X的loadingbuffer4μl酶切样品：pUC19酶切样品20μl+6X的loadingbuffer3μl(1)第二十六页，共四十五页，2022年，8月28日

DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。二者的作用机理类似。实验原理–

连接第二十七页，共四十五页，2022年，8月28日核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’-PO4末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。一个DNA片段的5’-PO4末端与另一个3’-OH末端相互靠近时，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+,ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。DNA连接酶作用机制实验原理–

连接酶焦磷酸根酶-焦磷酸根酶第二十八页，共四十五页，2022年，8月28日T4DNA连接酶作用机制：T4DNA连接酶作用分三步：(1)T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物。(2)酶－AMP复合物结合到具有5’－磷酸基和3’－羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。(3)产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.第二十九页，共四十五页，2022年，8月28日常用的DNA连接酶是T4DNA连接酶，其作用底物是双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子，可以连接粘性末端、平末端。T4DNA连接酶的活性用Weiss单位表示。1Weiss单位是指在37℃下20min内催化1nmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需的酶量。第三十页，共四十五页，2022年，8月28日T4DNA连接酶的最适反应温度为３７℃，为什么实验中采用１２～14℃？1.粘性末端形成的氢键在低温下更稳定；2.连接反应时间长，低温下酶不容易失活第三十一页，共四十五页，2022年，8月28日材料、试剂及器具1、材料与试剂连接反应：λDNA/EcoT14I:由11条DNA片段组成：19329、7743、6223bp、4254、3472、2690、1882、1489、925、421、74bpT4DNA连接酶及其配套的10×连接缓冲液检测：0.5×TBE电泳缓冲液6×电泳载样缓冲液、Goldview、琼脂糖第三十二页，共四十五页，2022年，8月28日2、器具：水平式电泳装置电泳仪,台式高速离心机恒温水浴锅（用PCR仪代理）微量移液枪微波炉或电炉紫外透射仪照相机及其附件第三十三页，共四十五页，2022年，8月28日（一）DNA片段的连接(注：每人一管）取200μl的离心管按下表加入试剂。↓混匀后点动离心，将溶液甩至管底↓置于已调好温度为12℃-14℃PCR仪中↓保温1-2h后取出↓电泳检测样品代号成分用量（μl）ddH2O7.0IλDNA/EcoT14I片段10.0f连接缓冲液2.0TT4DNA连接酶1.0总体积20实验步骤第三十四页，共四十五页，2022年，8月28日（二）DNA连接样品的电泳检测琼脂糖凝胶的制备：制备2块1.2%琼脂糖凝胶（0.48g/40ml）。第三十五页，共四十五页，2022年，8月28日（三）加样及电泳检测连接样品检测：λ/EcoT14I样品5μl（M2）DNA连接样品：20μl恒压电泳:130V电泳至溴酚蓝离凝胶外端1-2cm处，大约30-40分钟观察:紫外透射仪下观察电泳结果，并拍照记录。第三十六页，共四十五页，2022年，8月28日实验预期结果第三十七页，共四十五页，2022年，8月28日质粒及酶切样品电泳预期结果从左至右：1.λ/EcoT14IDNAMarker2.pUC19质粒3.pUC19质粒酶切样品123质粒不同构型的电泳行为线型DNA超螺旋DNA第三十八页，共四十五页，2022年，8月28日1234561：λ-EcoT14digest2,3：连接产物4：pUC19质粒5,6：酶切产物第三十九页，共四十五页，2022年，8月28日酶切反应注意事项

酶量，反应时间及体积

Oneunitofenzymeisdefinedasthequantityneededtocut1μgofDNAin50ulinonehour

反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少，可延长反应时间（16h)；反应体系不应太小,常规的酶切一般要维持在10-50ul。

酶的体积不要超过总体积的10%（甘油应在5%以下）。酶的使用：酶应永远放冰上，应是最后一个被加入到反应体系中，用完后及时放回冰箱

DNA的制备：待切割的DNA应当已去除酚，氯仿，乙醇，EDTA,去污剂或过多盐离子等

缓冲液：不同酶需不同离子强度缓冲液，使用前应将缓冲液完全溶解并充分混匀。

混匀：很重要，注意不可振荡反应温度：通常37℃终止反应：终止液，热失活，酚/氯仿抽提星号活性：在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列。第四十页，共四十五页，2022年，8月28日如果遇到酶切不动或切不完全，该怎么办？

酶是否有活性2)模板性质是否清楚：酶切效果与DNA的性质（线状，超螺旋状）、位点数目、位点左右的序列、甲基化程度、纯度等有很大的关系。对超螺旋状DNA完全酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍3)

模板纯度是否够4)

甲基化程度对酶的活性是否有影响5)

反应条件是否合适：温度，BSA,缓冲溶液，DTT6)酶稀释和添加方式是否正确：一般要求在最后加酶，提前混合，动作要快一些，没有分装前的Mix，要求放在冰里，尽快使用第四十一页，共四十五页，2022年，8月28日其它结果限制酶