实验改良法测定血清总胆红素和结合胆红素

实验改良法测定血清总胆红素和结合胆红素第一页，共二十九页，2022年，8月28日一.

目的要求掌握本法测定血清胆红素的基本原理。熟悉本法测定血清胆红素的基本操作步骤及参考值。了解临床测定血清胆红素的主要方法及意义。第二页，共二十九页，2022年，8月28日二．实验原理血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成紫色的偶氮胆红素；在同样条件下，未结合胆红素须有加速剂破坏胆红素氢键后才能与重氮试剂反应。咖啡因、苯甲酸钠作为加速剂，醋酸钠缓冲液可维持反应的pH值同时兼有加速作用。(叠氮钠破坏剩余重氮试剂，终止结合胆红素测定管的偶氮反应。)最后加入碱性酒石酸钠，在碱性条件下，紫色偶氮胆红素转变为蓝色偶氮胆红素，使最大吸光度由530nm转移到598nm，此时，非胆红素的黄色色素及其他红色与棕色色素产生的吸光度可忽略不计，使测定的灵敏度和特异性增加。最后形成的绿色是由蓝色的碱性偶氮胆红素和咖啡因对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成。第三页，共二十九页，2022年，8月28日三．器材及试剂1．器材：（1）试管（2）刻度吸管（3）紫外-可见分光光度计（4）恒温水浴箱第四页，共二十九页，2022年，8月28日三．器材及试剂2．试剂：咖啡因-苯甲酸钠试剂

称取无水醋酸钠14.0g，苯甲酸钠37.5g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）0.5g，溶于500ml蒸馏水中，再加咖啡因25.0g，搅拌至完全溶解（不可加热），用蒸馏水稀释至1000ml。混匀，过滤，置棕色瓶中，室温保存。碱性酒石酸钠溶液

称取氢氧化钠75.0g，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g，用蒸馏水溶解并稀释至1000ml。混匀，置塑料瓶中，室温保存(每排配150mL,计算后给老师确认后方可配制)。5.0g/L亚硝酸钠溶液

称取亚硝酸钠（NaNO2）0.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml，混匀，置棕色瓶中，4℃保存。若溶液呈淡黄色时，应丢弃重配。5.0g/L对氨基苯磺酸溶液

称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g，加蒸馏水800ml及浓盐酸15ml，待完全溶解后加蒸馏水稀释至1000ml，混匀(每排配100mL，计算后给老师确认后方可配制)。重氮试剂

临用前取5.0g/L亚硝酸钠0.5ml和5.0g/L对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀。第五页，共二十九页，2022年，8月28日三．器材及试剂2．试剂：胆红素标准

稀释血清：收集无溶血、无黄疸、无脂浊之新鲜血清，过滤。取过滤血清0.2mL，加入4.8mL新鲜生理盐水，混匀。以生理盐水调零，比色杯光径10mm，稀释血清在414nm吸光度应小于0.100，460nm吸光度应小于0.040。

胆红素标准液（171μmol/L或10mg/dL）:称取符合标准的胆红素（MW：584.68）10mg，加入二甲亚砜1mL，玻棒搅匀，加入0.05mol/LNa2CO3溶液2mL，使胆红素完全溶解。移入100ml容量瓶，用稀释血清洗涤数次并移入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/LHCl溶液2mL（边加边缓慢摇动，切勿产生气泡），最后用稀释血清稀释至100mL。避光，4℃保存，3天内有效，最好当天绘制标准曲线。第六页，共二十九页，2022年，8月28日四．操作步骤1．标准曲线的绘制：按下表配制5种不同浓度的胆红素标准液

将以上各管充分混匀（不产生气泡）。试剂(ml)/管别012345胆红素标准液(171μmol/L)0.00.20.40.60.81.0稀释血清1.00.80.60.40.20.0相当于胆红素浓度

μmol/Lmg/dl——34.268.4103137171246810第七页，共二十九页，2022年，8月28日四．操作步骤1．标准曲线的绘制：不同浓度的胆红素标准液按下表操作试剂(mL)

不同浓度的胆红素标准液0.2咖啡因-苯甲酸钠试剂1.6重氮试剂0.4

混匀，总胆红素管置室温15分钟，按下表继续操作：

碱性酒石酸钠溶液1.2每一浓度平行做二管，取平均值。用空白管调零，于波长600nm，读取各管吸光度，然后与相应的胆红素浓度绘制标准曲线第八页，共二十九页，2022年，8月28日四．操作步骤2．总胆红素的测定：取3支试管（总胆红素2组平行，空白管1管），标明总胆红素管和空白管，然后按下表操作试剂(ml)/管别总胆红素管空白管血清0.20.2咖啡因-苯甲酸钠试剂1.61.6氨基苯磺酸溶液—0.4重氮试剂0.4

—

混匀，总胆红素管置室温15分钟，按下表继续操作：

碱性酒石酸钠溶液1.21.2

充分混匀后，用空白管调零，于波长600nm，读取总胆红素管的吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。第九页，共二十九页，2022年，8月28日五．实验结果A总胆红素=？

血清总胆红素=？第十页，共二十九页，2022年，8月28日六．注意事项参考值

血清总胆红素5.1—19μmol/L(0.3—1.1mg/dl)

血清结合胆红素1.7—6.8μmol/L(0.1—0.4mg/dl)在10—37℃范围内，本测定方法不受环境温度影响，呈色在2小时内稳定。严重溶血时，可导致测定结果偏低。血脂可影响测定结果，故应尽量取空腹血。胆红素对光敏感，胆红素标准液及血清样本均应避光。第十一页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义胆色素代谢

胆色素(bilepigment)是体内铁卟啉类化合物的主要分解代谢产物，包括胆绿素(biliverdin)、胆红素(bilirubin)、胆素原(bilinogen)和胆素(bilin)等。胆红素处于胆色素代谢的中心，是人体胆汁中的主要色素。第十二页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义胆红素空间结构示意图胆红素的特有结构赋予其亲脂疏水的性质,易自由透过细胞膜进入血液。第十三页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义1.胆红素主要源于血红素的降解（1）胆红素主要源于衰老红细胞的破坏体内的铁卟啉化合物包括——血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化氢酶及过氧化物酶。正常人每天可生成250～350mg胆红素，其中约80%以上来自衰老红细胞破坏所释放的血红蛋白的分解。第十四页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义1.胆红素主要源于血红素的降解（2）血红素加氧酶和胆绿素还原酶催化胆红素的生成部位：

肝、脾、骨髓等单核吞噬细胞微粒体与胞液中。过程：血红蛋白血红素＋珠蛋白氨基酸胆红素第十五页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义1.胆红素主要源于血红素的降解（2）血红素加氧酶和胆绿素还原酶催化胆红素的生成胆红素的生成过程：第十六页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义2.血液中的胆红素主要与白蛋白结合而运输运输形式：胆红素-白蛋白复合体意义：一方面增加了胆红素的水溶性，提高了血浆对胆红素的运输能力；另一方面限制了它自由通透各种细胞膜，避免了它对组织细胞造成的毒性，起到暂时性的解毒作用。竞争结合剂：如磺胺药、水杨酸、胆汁酸等。第十七页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义3.胆红素在肝细胞中转变为结合胆红素并泌入胆小管（1）游离胆红素可渗透肝细胞膜而被摄取胆红素可以自由双向通透肝血窦肝细胞膜表面进入肝细胞；胆红素在胞浆与配体蛋白(Ｙ蛋白或Ｚ蛋白)结合，胆红素-Y蛋白或胆红素-Z蛋白形式将胆红素携带至肝细胞滑面内质网。第十八页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义3.胆红素在肝细胞中转变为结合胆红素并泌入胆小管（2）胆红素在内质网结合葡糖醛酸生成水溶性结合胆红素部位：滑面内网质反应：结合反应(主要结合物为UDP葡糖醛酸,UDPGA)催化酶：葡糖醛酸基转移酶产物：主要为双葡糖醛酸胆红素，另有少量单葡萄糖醛酸胆红素、硫酸胆红素，统称为结合胆红素。意义：胆红素与葡糖醛酸的结合是肝对有毒性胆红素一种根本性的生物转化解毒方式。第十九页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义3.胆红素在肝细胞中转变为结合胆红素并泌入胆小管（2）胆红素在内质网结合葡糖醛酸生成水溶性结合胆红素葡糖醛酸胆红素的生成:胆红素+UDP-葡糖醛酸胆红素葡糖醛酸一酯+UDPUDP-葡糖醛酸基转移酶胆红素葡糖醛酸一酯+UDP-葡糖醛酸UDP-葡糖醛酸基转移酶胆红素葡糖醛酸二酯

+UDP第二十页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义3.胆红素在肝细胞中转变为结合胆红素并泌入胆小管（2）胆红素在内质网结合葡糖醛酸生成水溶性结合胆红素两种胆红素理化性质的比较理化性质未结合胆红素结合胆红素同义名称间接胆红素、游离胆红素直接胆红素、肝胆红素与葡糖醛酸结合未结合结合水溶性小大脂溶性大小透过细胞膜的能力及毒性大小能否透过肾小球随尿排出不能能与重氮试剂反应间接阳性直接阳性第二十一页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义4.胆红素在肠道内转化为胆素原和胆素胆素原生成过程：结合胆红素胆素原肠菌葡糖醛酸还原胆素氧化游离胆红素第二十二页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义4.胆红素在肠道内转化为胆素原和胆素第二十三页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义5.高胆红素血症及黄疸（1）正常人胆红素的生成与排泄维持动态平衡正常血清胆红素浓度：3.4～17.1μmol/L（0.2～1mg/dl)。4/5为游离胆红素，其余为结合胆红素。高胆红素血症（hyperbilirubinemia)：体内胆红素生成过多，或肝细胞对胆红素的摄取、转化及排泄能力下降等因素引起血浆胆红素含量的增多。第二十四页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义5.高胆红素血症及黄疸（2）黄疸依据病因有溶血性、肝细胞性和阻塞性之分体内胆红素生成过多，或肝细胞对胆红素的摄取、转化及排泄能力下降等因素均可引起血浆胆红素含量增多，称为高胆红素血症(hyperbilirubinemia)。胆红素为橙黄色物质，过量的胆红素可扩散进入组织造成组织黄染，这一体征称为黄疸(jaundice)。第二十五页，共二十九页，2022年，8月28日七．相关知识与临床意义5.高胆红素血症及黄疸（2）黄疸依据病因有溶血性、肝细胞性和阻塞性之分当血浆胆红素浓度超过34.2μmol/L(2mg/dl)时，肉眼可见皮肤、粘膜及巩膜等组织黄染，临床上称为显性黄疸。若血浆胆红素升高不明显，在1～2mg/dl之间时，肉眼观察不到皮肤与巩膜等黄染现象，称为隐性黄疸(jaundiceoccult)。临床上常根据黄疸发病的原因不同，简单的将黄疸分为三类：（1）溶血性黄疸(hemolyticjaundice)；（2）肝细胞性黄疸(hepatocellularjaundic