非编码RNA研究方法及应用之环状RNA

环状RNA（CircularRNA,circRNA环状RNA是新近发现的一类特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点.环状RNA由特殊的选择性剪切产生，大量存在于真核细胞的细胞质中，具有一定的组织、时序和疾病特异性.这种分子有巨大潜力成为新的疾病诊断标志物.环状RNA由于结构的特殊性，容易在经典分离过程被丢弃，这是其一直被科学家忽视的重要原因.经典RNA测序方法只能分离具有特征“尾巴”的RNA，由于环状RNA首尾链接，没有尾巴，因此被普遍忽视，或许环状RNA的功能远远超过想像。2012年，斯坦福大学和霍华德休斯医学研究所的科学家在PlosOne发表的一项研究首次证实，人体细胞的基因表达时，环形RNA分子而非线性RNA分子是更普遍现象。2013年《自然》杂志的两篇研究主要针对1500个核苷酸大小的环状大RNA。小鼠和人类的大脑都可表达这种RNA分子，这种分子中包含70个miR的结合位点，简直就是miR的分子海绵。其中一项研究发现，环状RNA可以阻断miR-7功能，使被miR-7抑制的靶基因表达增高。研究证实斑马鱼环状RNA通过抑制miR-7效应影响大脑发育。

外显子circRNA：由套索驱动的环化形成，可经核孔复合体运输至胞质，具脱支酶抗性；内含子circRNA：由内含子配对驱动的环化形成，可经核孔复合体运输细胞质，具RNA外切酶抗性.A:miRNA分子“海绵”作用;B:影响RNA聚合酶延长并调控基因转录;C:与RNA结合蛋白相互作用调控翻译过程;D:在核糖体中被翻译为蛋白质.对于环状RNA的具体功能尚未有明确研究报道，目前只有几种假定的说法:1）circRNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，抑制其功能；2)circRNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；3）circRNA能与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性；4）circRNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。重要作用及研究意义：1）circRNA独具的竞争性内源（ceRNA）特征可为药物开发提供新的思路；2）circRNA的组织特异性和稳定性可能使其成为一种良好的生物标志物；3)circRNA的研究为生命的进化研究提供新的方向。circRNA功能特征研究策略一、环状RNA确定与筛选1）环状RNA生物信息学预测2)环状RNA高通量测序3）环状RNA表达丰度检测4）FISH检测环状RNA的亚细胞定位5）NorthernBlot检测环化RNA的存在二、环状RNA的功能研究1）环状RNA的过表达实验（Gainoffunction）2）环状RNA功能缺失实验（Lossoffunction）三、环状RNA的表达调控1）环状RNA与miRNA互作结合生物预测及实验验证2）环状RNA与miRNA相互作用预测研究3）环状RNA与蛋白相互作用研究circRNA筛选circRNA表达研究circRNA功能和机制研究二代测序及生物学分析筛选circRNA筛选方法：表达量高、差异倍数显著、位于网络的关键位置、在其他疾病中有过报道/本体基因对疾病有影响等。1.验证是否为真正的circRNA：q-PCR（RNaseR处理）,sanger测序2.表达及稳定性检测：q-PCR，Northrnblot等。3.定位：FISH实验。1.成环机制：CRISPR/Cas9技术2.沉默/过表达：对细胞/动物表型的影响3.作为miRNA分子海绵：荧光素酶报告实验4.与其结合的蛋白：RIP、pulldowncircRNA研究circRNA与肿瘤治疗

circRNA有望成为抗肿瘤靶向治疗的潜在靶点.与传统的仅含有一个microRNA应答元件(MRE)的线性miRNA海绵相比,circRNA海绵多含有数个MREs.在恶性黑色素瘤细胞系中,circRNA海绵表现出了优于线性海绵的抗癌效果.作为一种替代表达线性海绵的选择,表达circRNA海绵提供了一种产生持久海绵效应的方法。环状海绵或许是细胞内最佳的抑制miRNA活性的方式.由于circRNA含有更多的miRNA结合位点,因此其比典型miRNA抑制剂更有效。随着天然环化circRNA对miRNA管理的发现,RNA环或许是更合适的miRNA抑制剂载体,这或许可成为第二代miRNA抑制剂.这些合成circRNA抑制剂或许将成为未来的治疗靶点,并可能成为治疗癌症的新方法。ceRNA(competingendogenousRNAs)

ceRNA(competingendogenousRNAs)ceRNA假说揭示了一种RNA间相互作用的新机制。ceRNA假说揭示了一种RNA间相互作用的新机制。已知microRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默，而ceRNA可以通过竞争性地结合microRNA来调节基因表达。ceRNA可以通过应答元件(microRNAresponseelements，MREs)与microRNA结合从而影响microRNA导致的基因沉默，这揭示了一条RNA->microRNA调节通路的存在，具有重大生物意义。ceRNA代表一种全新的基因表达调控模式，比起miRNA调控网络，ceRNA调控网络更为精细和复杂，涉及更多RNA分子，包括mRNA、假基因、长链非编码RNA和miRNA等。2011年，Pandolfi等人在“AceRNAHypothesis:TheRosettaStoneofaHiddenRNALanguage?”这篇文章中，Pandolfi等人提出了一种关于信使RNAs如何转录假基因，以及长链非编码RNAs如何相互“交流”的新假说，这些进一步的研究将有助于癌症等疾病的分子机理的解析。Pandolfi等人提出了ceRNA（competingendogenousRNA，竞争性内源RNA）的假说，认为这种ceRNA活性能形成一种大规模转录调控网络，可以扩大人类基因组中的功能性遗传信息。他们认为这种活性通过miRNAs应答元件，可以作为mRNAs转录假基因，以及长链非编码RNAs相互“交流”的新语言。Pandolfi等人也认为ceRNA活性也在病理条件，比如癌症中扮演了重要角色，因此对于解开一些癌症研究之谜具有重要意义。数据库（1）starBase平台（/mirLncRNA.php）构建了最全面的CLIP-Seq实验支持的miRNA和lncRNA的调控关系网络,包括构建了ceRNA调控网络尽管microRNAs（miRNAs），其他的非编码RNAs（non-codingRNAs，ncRNAs（例如lncRNAs，假基因和circRNAs（circularRNAs，循环RNAs））和竞争性内源RNAs（competingendogenousRNAs，ceRNAs）涉及到细胞命运决定和各种人类疾病，然而令人惊讶地，对多种类型RNAs间的调控相互作用网络知之甚少。本研究中，我们开发了starBasev2.0（/）以从由37项独立研究产生的108套CLIP-Seq（PAR-CLIP、HITS-CLIP、iCLIP、CLASH）数据集中系统地鉴定RNA-RNA和蛋白质-RNA相互作用网络。通过分析数百万个RNA结合蛋白的结合位点，迄今为止，我们鉴定了约9000对miRNA-circRNA、16,000对miRNA-假基因和285,000对miRNA-mRNA和miRNA-lncRNA相互作用网络。我们从CLIP支持的miRNA靶位点中鉴定了约10,000个ceRNA对。通过结合13种功能基因组注释，我们开发了miRFunction和ceRNAFunction网络服务器以从miRNA介导的调控网络中预测miRNA和其他ncRNA的功能（/mrnaCeRNA.php）（2）DIANA-LncBase数据库（www.microrna.gr/LncBase）构建了基于单个CLIP-Seq数据的miRNA和lncRNA调控关系。（3）lnCeDB：充当竞争性内源RNA的人类长链非编码RNA数据库长链非编码RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）通过干扰microRNA（miRNA）通路，充当竞争性内源RNA（ceRNA）影响转录后调控。这些lncRNAs中有miRNA响应元件（miRNAresponsiveelements，MRE），并控制与它们的靶mRNAs结合的可用内源性miRNAs，因此减少这些mRNAs的抑制。lnCeDB提供了一个能够潜在地充当ceRNAs的人类lncRNAs数据库（来自GENCODE19版）。分别从TargetScan和StarBase中收集了人类miRNAs推断的mRNA靶和比对到AGO剪裁区的靶。从miRCode数据库中下载了人类miRNAs的lncRNA靶（更新至GENCODE11）。通过我们的找到种子匹配靶位点算法预测了靶向剩余GENCODE19lncRNAs的miRNA。这些推断的miRNA-lncRNA相互作用被用被比对到lncRNAs中的Ago相互作用区。为了找出一个lncRNA-mRNA对真正成为ceRNA的可能性，我们求助于两种方法。第一，从ceRNA对间共享的MREs数与个别候选基因的MREs总数比中计算了一个ceRNA值。第二，通过使用ceRNA对间共享的miRNAs数针对个别RNAs相互作用的miRNAs数的超几何检验确定了每个ceRNA对的P值。典型地，在被公共miRNA(s)靶向的一对RNAs中，应该有一个表达关联，因此增加一个ceRNA的水平导致其他ceRNA水平的增加。几乎等摩尔的竞争性RNAs浓度与更加深刻的ceRNA效果关联。在InCeDB中，人们不仅能够浏览被共同miRNAs靶向的lncRNA-mRNA对，而且能够比较22种人类组织中的lncRNA-mRNA对的表达以估计该对真正成为ceRNAs的几率。可用性：从/lncedb/免费下载。（4）竞争性内源RNA数据库ceRDB一个给定mRNA能够通过与miRNAs相互作用而被调节，反过来这些miRNAs的有效性能够通过它们与另外mRNAs的相互作用而被调节。一个给定mRNA利用与miRNAs相互作用的功效，通过共享的miRNA响应元件（miRNAresponseelements，MREs）被另外的mRNA（竞争性内源mRNA）调控的概念正成为一种基础遗传调控机制。mRNA-mRNA交互的分子基础是通过miRNA响应元件，它们能够基于分子相互作用和进化保守型进行预测。通过研究miRNA响应元件在全基因组mRNA中的同现性，我们为被miRNAs靶向的特异mRNA预测了竞争性内源RNA。与最近发表的工作中预测的调控PTEN的mRNAs相比，表明竞争性内源RNA数据库（ceRDB）中呈现的结果具有生物相关性。可用性：/cefinder/。ceRNA的研究进展1.1人工合成的miRNA“海绵”作为ceRNA的研究

2007年，麻省理工大学的Ebert等开发了一种高效的miRNA抑制剂，他们称之为miRNA“海绵”(miRNAsponge)。包含若干个miRNA靶定位点。更重要的是，这些靶定位点与RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)切割位点有一些错配。合成的miRNA“海绵”就不会被降解，而与RISC稳定结合，让它远离天然的靶点。相对于miRNA“海绵”而言，ceRNA的优势在于可以抑制多种miRNA的活性，通过改变miRNA应答元件的种类和数量，可起到网络调控的作用。为此，Tang等开发了一种人工ceRNA，称为短串联靶标类似物(shorttandemtargetmimic,STTM)，可以有效抑制多种miRNA的功能。1.2假基因转录本作为ceRNA的研究

假基因(pseudogene)是在基因组内，结构上与编码某一蛋白质的结构基因相似，在进化过程中获得突变而丧失了产生蛋白质产物能力的序列片段。假基因转录本如果作为候选ceRNA，必须满足可以转录而且进化保守的特点。2010年发表了一篇Nature文章，是关于肿瘤抑癌基因磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)基因及其假基因1(PTENP1)的转录物有一部分高度同源的序列，PTENP1可以被调控PTEN的miRNA所调控，这种受相同miRNA共调节的关系使得过表达PTENP1引起PTEN的mRNA和蛋白质表达增加，进而发挥肿瘤抑制作用，在缺乏miRNA的细胞内，则PTENP1对PTEN的调控将明显减弱。2014年最新研究发现，在X和Y染色体上，肿瘤抑制基因候选-2假基因(TUSC2P)与其在3'UTR区相应蛋白质编码转录物肿瘤抑制基因候选-2(TUSC2)高度同源。TUSC2的3'UTR区和TUSC2P有多个相同miRNA结合位点，包括miR-17、miR-93、miR-299-3p、miR-520a、miR-608和miR-661。研究发现异位表达的TUSC2P和TUSC2的3'UTR区抑制了细胞的增殖、存活、迁移和集落形成，增加了肿瘤细胞的死亡。通过内生的miRNA相互影响，TUSC2P和TUSC2的3'UTR区吸收了这些miRNA，导致TUSC2的翻译增加。lncRNA作为ceRNA的研究Cesana等研究人和鼠的骨骼肌分化过程发现，lncRNA可以竞争性结合miRNA，调控miRNA及其靶基因的表达，同时也受到miRNA的调控。通过高通量转录组学技术筛选出一个叫做肌分化长链基因间RNA1(linc-MD1)的lncRNA，受到严格的调控。在未分化的肌细胞中，miR-133和miR-135可分别结合决定因子样蛋白-1(MAML-1)和肌细胞特异性增强因子2C(MEF2C)基因的mRNA，并抑制其表达。linc-MD1含有这两个miRNA的结合位点，分化过程中高表达的lincMD1竞争性结合细胞中的miR-133和miR-135，降低了这两种miRNA的游离浓度，从而解除了对肌肉分化相关蛋白质因子的抑制作用,促进细胞分化。肝癌高表达转录本(HULC)是一种在肝癌细胞中高表达，而在干细胞中低表达的lncRNA。研究发现，转录后的HULC可以与miR-372配对结合，起到类似ceRNA的作用，能吸附并竞争性抑制miR-327等miRNA的活性，影响相关基因的表达。Faghihi等发现，β分泌酶编码基因(BACE1)座位能转录出1条lncRNA(BACE1反义RNA)，这条反义RNA可以和BACE1基因的mRNA互补，通过竞争性抑制miRNA对BACE1基因降解。Karreth等利用小鼠作为实验模型，发现了锌指E-box结合同源框2(ZEB2)的mRNA和PTENmRNA产生竞争性作用。当ZEB2mRNA低表达时，PTEN的蛋白表达下降；而过表达了ZEB2mRNA之后，PTEN的蛋白表达增高。他们并运用了免疫共沉淀的方法，指出了miR-92a、miR-25等miRNA在ZEB2的RNA和PTEN的mRNA上有共同的结合位点。编码蛋白的mRNA作为ceRNA的研究研究发现，过表达多能蛋白聚糖(versican)mRNA的3'UTR，可以竞争性结合miR-199a-3P、miR-136和miR-144，解除了这些miRNA对视网膜母细胞瘤1(retinoblastoma1,RB1)基因和PTENmRNA转录后抑制作用，提高了它们的蛋白质表达水平。Jeyapalan等过表达分化群44(CD44)抗原mRNA的3'UTR，这种3'UTR能竞争性结合miR-216a、miR-330和miR-608，从而解除了这些miRNA对CD44本身以及细胞分裂周期蛋白42(CDC42)的转录后抑制作用。circRNA作为ceRNA的研究小脑变性相关蛋1(CDR1as)的环形天然反义转录物具有60多个miR-7的结合位点，当CDR1as表达高时，能大量结合miR-7，导致miR-7靶标表达水平升高；当CDR1as表达低时，结合少量miR-7从而导致miR-7靶标表达水平降低。目前已有一些实验证实了circRNA作为体内ceRNA的作用是较为普遍的，为miRNA在细胞内的调控方式研究提供了新的思路。circRNA在基因表达调控中重要作用的发现不仅丰富了人们对ceRNA调控网络的认识，而且提示circRNA在药物开发和疾病诊治中具有良好的应用前景。ceRNA的研究策略1.结合下一代测序技术(NGS)的运用下一代测序技术是利用一系列高通量测序技术进行大规模的基因组DNA或者RNA测序，能快速准确获得基因组编码序列。目前，结合下一代测序技术，ceRNA研究中常用的分子生物学研究方法有：微列阵(microarray)、RNA测序(RNA-seq)、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)、染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)等。RNA-seq通过高通量测序技术分析包括mRNA、小分子RNA、非编码RNA等RNA转录本种类，同时还可以反映RNA的表达水平，可准确地分析出组织细胞的基因表达谱。利用该技术对来源于诱导多能干细胞iPSC)的人类神经元进行了测序，发现了多种lncRNA参与神经发生和神经系统的疾病发生。

RIP是研究细胞内RNA与蛋白质结合情况的技术，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。目前，RIP技术也有了衍生的新方法，RIP与RNA-seq结合发展成为RIP-seq，应用于癌症以及其他疾病整体水平的RNA变化检测。Chakraborty等最新报道了非编码RNA沉默与定位分析(c-KLAN)技术，可对lncRNA进行功能缺失研究和细胞定位。2.生物信息学分析在研究抑癌基因PTEN的ceRNA时，研究者用了一种叫做MuTaME(mutuallytargetedMREenrichment)的生物信息学分析方法。随着对ceRNA研究的逐步深入，现已建立了几个ceRNA相关的数据库。Sarver等建立了首个ceRNA数据库(ceRDB)，可用于预测互为ceRNA的mRNA。Liu等建立了长链基因间非编码RNA(lincRNA)数据库Linc2GO，用于注释lincRNA的功能。ceRNA表达上的一致性ceRNA和它的靶mRNA存在如下关系：当ceRNA的数量减少时，因为其吸引相应miRNA的数目较少，miRNA抑制固有靶mRNA的作用较强，使其表达减少；当ceRNA的数量增多时，因为其可结合较多的miRNA，使得miRNA固有靶mRNA得以解除抑制，表达增多。因此，对于某一RNA来说，它和它的ceRNA之间的表达水平存在着同向变化的特点。ceRNA和相应的miRNA之间表达部位是一致。在Hansen等研究circRNA时，由于神经组织中含有丰富的miR-7，他们在小鼠的胚胎脑组织E13.5做了原位杂交染色，从形态学上观察到了有基本重叠表达的神经组织，提示了CDR1as和miR-7可能拥有类似的功能。3'UTR对ceRNA作用的影响ceRNA之间的相互调节作用是依赖于miRNA和3'UTR的，当细胞内缺乏miRNA或3'UTR突变之后，该调节作用就不存在了。miRNA在ceRNA网络中起着核心的作用，任何彼此调控的ceRNA之间，都是通过miRNA池介导来实现的，而miRNA主要通过与转录物的3'UTR的miRNA应答元件互补配对来降低基因的表达。有研究表明，mRNA的翻译可以限制miRNA的沉默功能，使miRNA结合位点限制于3'UTR内。因此，不受翻译活性干扰，可以高效结合miRNA的非编码RNA更适合ceRNA理论的研究。ceRNA功能的鉴定ceRNA网络的验证包括对miRNA与RNA之间和ceRNA之间相互作用的验证两个方面。MiRNA与mRNA之间相互作用的鉴定(1)确认miRNA与RNA之间存在物理上的结合Salmena等利用RIP技术(RNABindingProteinImmunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀)技术将miRNA和PTEN的3'UTR进行共沉淀，然后用实时定量PCR进行检测，发现沉淀物中确实富含预测的miRNA。(2)确认miRNA对靶RNA有抑制作用在细胞中过表达或抑制miRNA，然后用RT-PCR、WesternBlot和荧光素酶报告法检测miRNA对转录物转录水平、蛋白质水平及3'UTR活性的影响。由于miRNA可以通过Dicer酶使mRNA降解，也可直接阻碍翻译过程，从这两个水平进行检测可以具体分析其作用方式。此外，构建靶点突变型的荧光素酶报告质粒可以检测抑制作用是否是通过之前预测的MRE位点发生的。若靶RNA具有明确的生理活性，还可进一步检测其下游的信号通路、细胞特性的改变情况。如果能进行活体实验，比如移植瘤实验或是使用转基因小鼠，则更具有说服力。(3)确认靶RNA对miRNA有抑制作用当miRNA具有已证实的靶基因或生理功能时，可以据此进行检测。比如，miR-372能帮助细胞克服p21介导的细胞周期运转阻滞。Wang等人用HULC的抑制剂H89处理细胞后，检测到细胞周期运转的加强，从而证明HULC能抑制miR-372的活性。以PTEN为例，当PTEN的ceRNA表达上调在miRNA表达水平不变的前提之下，PTEN的表达水平上调从而抑制肿瘤细胞的增殖，反之则会促进肿瘤细胞的增殖。Karreth等在动物水平上也做了相应的证明。当ZEB2mRNA表达抑制时，PTEN的蛋白表达降低，从而激活了磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号传导通路，发现小鼠肿瘤生长速度增快；而ZEB2mRNA过表达时，PTEN蛋白表达升高，小鼠肿瘤生长速度减慢。目前对于ceRNA的研究基本都集中在肿瘤方向，近年来已有研究证实，ceRNA和前列腺癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤相关，调控肿瘤的发生发展。以肝癌为例，已发现存在多个ceRNA调控作用。功能学验证ceRNA间的相互作用的鉴定与验证miRNA与RNA之间的相互作用类似，验证ceRNA的关系是通过检测一种基因的RNA变化时，其它基因的转录产物、翻译产物、下游的信号通路及相关细胞或机体表型的改变情况。使用Drosha或Dicer突变型细胞可检测其相互作用是否是通过miRNA介导的;而过表达mRNA的3'UTR区，或构建其荧光素酶报告体可以验证相互作用是否发生在3'UTR区;也可转染MRE缺失的突变体以进一步确认作用位点。实验验证是通过生化手段对预测的靶标进行核查，它虽然能大大提高预测结果的可信度，但由于存在诸多的不可控因素，与实际情况还是有一定的偏差。在实验时应根据需要合理选用细胞类型，并选用多种不同的细胞系。ceRNA调控机制的异常可导致癌症和其他疾病的发生，为明确肿瘤的发生机理提供了新视角，与miRNA的相互竞争作用也给肿瘤临床治疗带来新方法。尽管ceRNA网络工作的具体分子机制需要大量实验来证实，但目前以ceRNA方式检测转录子上的MRE并识别相关性miRNA的新技术已成为现实。ceRNA的MRE可结合多种不同的miRNA。因此，ceRNA海绵体能调节多个miRNA的多种靶标基因，其抑制miRNA的功能在临床治疗方面可能是一种理想的选择。虽然miRNA海绵、ceRNA海绵在miRNA功能失活方面的研究为临床治疗提供了新思路，但如何消除脱靶效应，以及进一步评估两者之间的潜在作用仍须深入探究。人们常常需要下调或上调miRNA和mRNA的表达，这里也有很多值得注意的地方。当进行过表达时，确定合适的过表达量很关键，既要足以产生明显的实验现象又要考虑到避免超出细胞或机体的生理限度。研究表明，当过表达特定的miRNA时，这些miRNA会竞争性结合RISC，导致其他内源miRNA不能与RISC结合而无法发挥其抑制基因表达的作用，导致它们靶基因表达量升高，从而可能干扰我们的实验结果。使用siRNA等方法抑制基因表达时，除了要考察其干扰的效率还要注意避免产生脱靶效应，尤其是在研究基因与假基因间的相互作用时，由于二者序列同源性很高，对siRNA序列的优化就显得异常重要。ceRNA网络图的构建多数的研究主要集中在一个或几个miRNA介导的一对ceRNA之间相互作用、影响的信号通路以及与疾病相关性的确证，但这只是整个ceRNA网络中的几个节点。人们希望从整体水平上了解ceRNA网络，于是有研究者绘制出了不同条件下的ceRNA网络图。简单的ceRNA网络图可以通过总结已知的miRNA-mRNA作用情况得到。这种总结性的关系图确实可以给人们带来一定的启发，不过它与完整的网络图之间还有很大的差距，而且只适用于人们研究较多的生理或病理过程。于是有研究者借助生物信息学手段绘制了更为庞大的ceRNA网络图。Sumazin等用Hermes方法分析恶性胶质瘤表达谱中任意两个基因间所共有的miRNA组(commonmiRProgram)，然后以RNAs作为节点，以其mPR(miRprogrammediatedregulatory)交互作用绘制恶性胶质瘤细胞中由miRNA组介导的大型RNA互作图。除了这些特定疾病中的ceRNA网络，ceRNA数据库也已经出现。ceRDB是Aaronr等利用Targetscan数据构建，只要输入一个mRNA的名称，就可以搜索到与其共有miRNA数量最多的前50个甚至前500个mRNA作为候选的ceRNA。starBasev2.0是中山大学的Yang等通过整合大量的芯片数据和肿瘤样本，提供miRNA-lncRNA、miRNA-mRNA、ceRNAnetwork和蛋白-RNA等的相关性预测和基因功能分析。但它们的缺点是过分依赖miRNA靶基因预测软件。目前各预测软件都是根据已知的miRNA和靶基因间作用的规律性来设计算法，但其侧重点有所不同，彼此之间预测结果的交集往往很小，甚至同一软件的不同版本的预测结果也在不断变化。此外，miRNA的多靶基因特性也与细胞状态有关系，这是任何算法都难以预测的。从ceRNA的研究现状来看，生物信息学已与各种实验验证方法占到了同等重要的地位。无论是靶标的预测还是对基因的表达、功能和相互作用的分析都离不开相关的计算机软件及数据库。虽然目前各预测算法的准确度和灵敏度还不高，ceRNA数据库也在不断完善中，但随着ceRNA发现的增多，miRNA和靶基因作用机制的阐明，预测结果的可信度也将进一步提高，从而使生物学家能更有针对性关注特定的miRNA靶基因进行研究。在实验验证方面，由于ceRNA网络是一个高度复杂的动态网络，对周围环境十分敏感，人们需要进行严密的实验设计并优化实验条件，或是开发新的更有效的实验方法，只有这样才能不断减少人为因素的干扰并提高实验结果的说服力。此外，结合基因本体(GO)分析、信号通路分析、相互作用组(Interactome)和蛋白质组学，从不同角度全方面认识ceRNA网络，将带给人们新的启发。外泌体circRNA作为biomarkerIF：14.812肝癌细胞外泌体中的circRNA与相应的线性RNA数量比例显著高于肝癌细胞中的。为了验证circRNA和miRNA的关系，将miR-7转入细胞，检测细胞及外泌体中CDR1as的水平，结果显示外泌体中CDR1as的表达量显著减少。健康人血清exosomes检测到1215个circRNAs；qPCR结果显示在RnaseR处理后circRNA表达量没有发生显著变化；室温下放置24h表达量基本没有变化。小鼠成瘤实验验证肿瘤细胞exosomescircRNAMHCC-LM3(高转移人肝癌细胞)裸鼠成瘤实验，提取肿瘤细胞exosomesrna进行环状RNAqRT-PCR检验，humanCDYLcircRNA显著差异表达，并且exo-circRNA丰度与成瘤大小呈正相关。结肠癌病人和正常人的血清外泌体circRNA有很大差别，与正常人相比，结肠癌病人有257newcircRNA。qRT-PCR验证结果显示，结肠癌血清中circ-KLDHC10表达显著升高。exo-circRNA有望成为癌症诊断biomarker案例3提取检测：分别从缺氧(1%O2)或正常(20%O2)培养的OSCC(口腔鳞状细胞癌)细胞培养基上清提取exo(外泌体)，扫描电镜观察形态，Westernblot检测exomarkerCD63和CD81。

source：cellresearchIF：14.812缺氧肿瘤细胞分泌的exosome能影响正常肿瘤细胞吗？给缺氧exosome(缺氧培养的细胞分泌的exo)添加荧光PKH67标签，孵育OSCC细胞，荧光显微镜下观察显示PKH67标记的exosome(绿色)被OSCC细胞内化吸收。缺氧exosome对OSCC细胞迁移和入侵有何作用？敲降细胞的HIF-1α或HIF-2α，提取exosome后孵育细胞，进行细胞划痕实验，结果显示缺氧exosome增强癌细胞迁移和入侵，但敲降后exosome不能。为什么缺氧exosome有此功能？或许是exosomalmiRNA起的作用方法：OSCC细胞株Cal-27正常或缺氧培养24h，从细胞培养基提取exo，提取总RNA，进行miRNA测序。

通过测序得到了差异表达miRNA，下一步做什么？选择差异显著的miR-21作为接下来的研究对象，研究它与HIF-1α、HIF-2α的关系。敲降HIF-1α、HIF-2α，检测cell、exosome中miR-21水平以及ChIP实验,结果显示缺氧诱导细胞、exosome表达miR-21，是通过HIF-1α、HIF-2α与miR-21HRE区结合实现的。方法：敲降缺氧或正常细胞的miR-21，提取exosome后孵育细胞，进行划痕实验；敲降HIF-1α、HIF-2α后再过表达miR-21，显示miR-21是缺氧exosome诱导细胞迁移、入侵所依赖的。动物实验方法：将Cal-27细胞皮下注射到nu/nu小鼠，生成60mm3肿瘤。注射缺氧或正常exosome(10ug)到移植瘤中央，检测各种指标，显示肿瘤exosome的miR-21诱导移植瘤的生长和转移。临床样本分析从OSCC病人血清提取exosome(OSCCexo)，检测miR-21水平。非编码RNA整合分析lncRNA、miRNA分别与mRNA可以通过靶向关系进行关联，lncRNA/circRNA与miRNA可以通过相互结合位点进行关联，mRNA和mRNA之间可以通过蛋白质互作关系进行关联，从而可以形成ncRNA-mRNA-protein的互作网络。

（1）mRNA-miRNA（2）mRNA-lncRNA（3）mRNA-lncRNA-miRNA（4）mRNA-miRNA-circRNA转录组整合分析竞争性内源RNA（ceRNA）分析流程TotalRNAlncRNA测序miRNA测序circRNA测序miRNA/lncRNA/mRNA/circRNA标准分析关联分析构建调控网络差异表达的lncRNA/miRNA/circRNA/mRNA差异ncRNA靶基因与差异mRNA交集富集分析整合分析类型（1）mRNA-miRNA（2）mRNA-lncRNA

（3）mRNA-lncRNA-miRNA

将差异mRNA、差异lncRNA靶基因、差异miRNA靶基因取并集，对其进行GO和KEGG富集分析，还可与差异lncRNA、miRNA构建共表达调控网络。（4）mRNA-miRNA-circRNA

将差异mRNA、差异miRNA靶基因、差异circRNA靶基因取并集，对其进行GO和KEGG富集分析，还可与差异circRNA、miRNA构建共表达调控网络。案例1High-throughputdataintegrationofRNA–miRNA–circRNArevealsnovelinsightsintomechanismsofbenzo[a]pyrene-inducedcarcinogenicity研究目的：通过对mRNA，miRNA，circRNA整合分析，从而更深入的了解化学物质诱导细胞致癌的机理。研究背景：本文作者已经利用二代测序技术对苯并芘处理的HepG2细胞进行了mRNA测序，发现一些转录本的新亚型和可变剪切是由苯并芘刺激产生的，尤其是参与DNA损伤反应和凋亡的基因（TP53,BCL2,XPA）。为深入了解致癌机制，作者又对其进行mRNA、miRNA和circRNA测序，进行整合分析。杂志：NucleicAcidsResIF：9.202发表时间：2015.03研究思路实验结果BaP刺激后的HepG2mRNA表达水平

通过测序在6个时间点共找到1143个差异表达的mRNA，GO富集分析显示基因在“细胞响应（药物、杀虫剂、致癌物等）异型生物质的刺激”term中显著富集，因此证实HepG2的确能有效响应苯并芘刺激。BaP刺激后的HepG2miRNA表达水平16个成熟的miRNA在整个BaP处理过程中被显著地影响，但只有miR-181a-13p在整个处理过程中过表达。在多个时间点差异表达的5个成熟miRNA均是miR-181家族成员（(miR-181a-15p,miR-181a-25p,miR-181b-15p/3p，miR-181b-1）。有趣的是miR-181家族也被报道参与肝癌诱发机制。文献解读

文献解读circRNA预测

本研究结果显示只有17个circRNA在所有的样本中存在，其中有几个circRNA在不同时间点是差异表达的，但是在整个处理过程中没有表现出一致的变化趋势。文献解读整合分析：mir-181a,DNArepairgenes和circRNA

共有328个基因的3'UTR与miR-181a-13p种子序列互补，其中14个基因在受到BaP处理后差异表达。作者发现差异表达的MGMT(O6-methylguanineDNAmethyltransferase)能防止DNA复制时发生突变或染色体变异，它主要在肝脏组织表达，先前报道显示MGMT的消耗可增加致癌风险。MGMT在BaP处理的24h内表达被抑制，可能一部分是由于miR-181a-13p对它进行抑制或降解。在36h时表达量开始增加，可能是由于一些circRNA与miR-181a-13p结合，解除了对MGMT的抑制。文献解读文献解读案例2

样本：来自50个病人膝关节的损伤软骨与完整软骨主要结果：损伤软骨与完整软骨比较，有107个lncRNA差异表达，51个上调，56个下调。其中TMSB4pseudogene,lncRNA-MSR显著上调，在受到机械压力时被激活。另外，lncRNA-MSR通过与miRNA-152竞争来调节TMSB4的表达。发表时间：2016.06IF：6.938发表时间：2016.03IF：5.228新lncRNA-MSR显著上调，其本体基因是TMSB4lncRNA测序mRNA测序正常软骨损伤软骨COL2A1、ACAN显著下调，TMSB4、MMP13、ADAMTS5显著上调筛选差异的lncRNAMSR敲除实验MSR过表达实验机械压力实验预测出与MSR/TMSB4均互补的miR-152，miR-217miR-152抑制MSR/TMSB4的表达双荧光素酶报告实验

lncRNA-MSR可作为ceRNA调节TMSB4的表达--软件预测出2个miRNA（miR-152，miR-217）与MSR、TMSB4序列均互补。荧光素酶报告实验表明MSR、TMSB4可被miR-152显著抑制，而没有受到miR-217的影响。另外，miR-152的过表达可抑制MSR、TMSB4的表达，相反地，miR-152被抑制后可增加MSR、TMSB4的表达。案例3--外显子+转录组MutationsandalteredexpressionofSERPINF1inpatientswithfamilialotosclerosis

杂志：HumanMolecularGenetics影响因子：5.985发表日期：2016.03文章简介：作者对10个家族遗传性耳硬化症病人（来自4个家族）进行外显子测序，找到23个候选变异位点。另外又对84个病人和175个正常个体进行sanger检测，共有6个罕见杂合突变发生在SERPINF1基因上，3个为错义突变，3个发生在SERPINF1-012转录本的5-UTR区。RNA-seq分析表明SERPINF1-012是主要的转录本类型，5-UTR区的突变可影响转录本的表达量。外显子+转录组通过外显子测序和sanger验证，共发现6个罕见杂合突变发生在SERPINF1基因上。软件预测显示c.167C>G,c.331G>A，c.392C>A突变为有害变异，而其余三个对SERPINF1-001为非有害变异，并且位于SERPINF1-012转录本的5'-UTR区。外显子+转录组

RNA-seq对SERPINF1每个外显子上的reads数量进行统计发现exons5–8的reads数量远大于exon1-4，说明SERPINF1-012是基因SERPINF1的主要转录本亚型。与对照组相比，耳硬化症病人和SERPINF1-012的5‘-UTR区发生突变（c.601G>A）的病人组织中基因表达量均显著降低，表明在SERPINF1-012的5‘-UTR区的突变会影响转录本的表达量。RT-qPCR证实SERPINF1-012的5’-UTR区发生突变导致其表达量降低。对野生型及5‘-UTR区突变的序列构建荧光素酶报告系统，与野生型相比，c.440-40_440-38delTCG和c.441G>C荧光素酶活性显著减小，说明这两个位点的突变可导致SERPINF1-012翻译效率降低；而c.601G>A的突变使SERPINF1-012翻译效率增加。案例4转录组+DNA甲基化研究目的：通过DNA甲基化和转录组测序，对数据进行整合分析以揭示急性淋巴细胞白血病的发病机制。分析内容：DNA甲基化峰值的分布差异甲基化区域内基因的筛选差异表达lncRNA的筛选关联分析研究思路关联分析19pre-BALLpatientsamples10NormalprecursorB-cellpopulations结果甲基化和转录组数据关联分析显示，在ALL病人中，62个基因（MTSS1,PAWR,EXT1）启动子的差异甲基化区域（DMRs）高度甲基化而基因表达下调，主要参与转录调节和细胞凋亡；37个基因启动子DMRs呈现低甲基化而表达上调，主要参与GTP酶的激活和细胞增殖调节。除了蛋白编码基因外，差异甲基化还发生在