第八章生长繁殖

第八章

微生物的生长繁殖及其控制第一节微生物生长的研究方法一、微生物的分离纯化方法：（1）平皿划线法（2）稀释倒平皿法（3）稀释涂布法（4）选择培养基分离法（5）单细胞挑取法（6）利用环境条件控制法二、实验室培养法固体培养法好氧菌的固体培养：试管、平皿、三角瓶厌氧菌的固体培养高层琼脂柱厌氧培养皿Hungaterool-tubetechnique厌氧罐技术厌氧手套箱技术液体培养法好氧菌的液体培养厌氧菌的液体培养试管液体培养三角瓶浅层液体培养台式发酵罐摇瓶培养..................Brewer皿.....................高层琼脂柱亨盖特技术培养厌氧菌的试管及平皿AnaerobicGloveBox三、生产实践中培养微生物固态培养法好氧菌-曲法培养厌氧菌的堆积培养深层液体通气培养——发酵罐（Fermenter）液体培养法浅盘培养三、测定生长繁殖的方法既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定生长的方法也都直接或间接地以此为根据，而测定繁殖要建立在计数这一基础上。一、微生物细胞数目的测定（一）比浊法细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物浑浊度的增高。如果要作精确测定，则可用分光光度计进行。在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。直接计数法只适用于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。1、比例计数法将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。（二）直接计数法直接法就是指在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法，所得的结果是包括死细菌在内的总菌数。采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；2、血球计数板法用来测定一定容积中的细胞总数目的常规方法。（三）平板菌落计数法一种活菌计数法，是根据活细胞通过生长繁殖会在平板培养基表面形成菌落的原理而设计的方法。对未知样品进行一系列十倍稀释，然后取一定体积的稀释菌液涂布于琼脂平板上，保温培养直到菌落出现，记录菌落数目并换算成每毫升试样中的活细胞总数。它是一种最常用的活菌计数法采用培养平板计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果：样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重复,取平均值；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；涂布平板法和稀释倒平板法一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。以上介绍了若干测定微生物的生长繁殖数的主要方法，其中，最常用的为测浊度（用分光光度计）、用计数板测总菌数以及用平板菌落计数法测活菌数等方法。在使用前，一定要根据自己的研究对象和研究目的的不同，选用最合适的方法。3、测含氮量根据样品中菌体蛋白质含量计算微生物重量的方法。氮是蛋白质的稳定成分(蛋白质量=6.25×总含N量)4、测含碳量5、其他（例如：磷、DNA、RNA等）1、湿重法2、称干重可用离心或过滤后干燥，称重，一般干重为湿重的10~20%。二、测定生物量和生理指标与生长量相平行的生理指标很多，它们都可用作生长测定中的相对值。微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。常用于对微生物的快速鉴定与检测生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。生长：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。繁殖：生长、繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提第二节微生物的生长规律微生物的生长表现在微生物的个体生长和群体生长两个水平上。个体生长个体繁殖群体生长在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）微生物生长:一、个体生长和同步生长要研究单个细菌细胞内,所发生的生物化学变化和细胞学变化,目前使用的方法:一是用电子显微镜观察细菌细胞的超薄切片二是使用同步培养技术(Synchronousculture)同步培养:设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中,然后分析此群体的各种生物化学特征,从而了解单个细胞所发生的变化。同步生长：这种通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态，就称同步生长。获得细菌同步生长的方法主要有两类：通过环境条件来诱导同步性温度培养基成份控制其他：如光照和黑暗交替培养选择性过滤梯度离心法硝酸纤维素滤膜法硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。通过物理学方法从随机的、不同步细菌群体中选择出同步的菌体二、单细胞微生物的典型生长曲线生长曲线(GrowthCurve)：把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的温度、通气（厌氧菌则不能通气）等条件下，它们的群体就会有规律的生长起来，以细胞数目的对数值做纵坐标，以培养时间为横坐标，就可以画出一条有规律的曲线，这就是微生物的生长曲线。二、典型生长曲线细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图一条典型的生长曲线至少可以分为：迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期根据微生物的生长速率常数（growthrateconstant），即每小时的分裂代数（R）的不同。二、典型生长曲线又称停滞期、调整期或适应期。指少量微生物接种到新培养基中后，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。（一）延滞期（lagphase）生长速率常数等于零。细胞形态变大或增长例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于延滞期的细菌细胞体积最大。细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈噬碱性。合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感（如：温度、NaCl溶液浓度、抗生素等）。（一）延滞期（lagphase）延滞期特点：影响延滞期长短的因素很多，除菌种外，主要有三个。接种龄接种量培养基成分延滞期出现的原因：调整代谢，合成新的酶系和中间代谢产物以适应新环境。

如何缩短延滞期？在生产实践中缩短延滞期的常用手段：(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使延滞期缩短；(2)利用对数生长期的细胞作为种子；(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；(4)适当扩大接种量；（二）指数期（exponentialphase）又称对数期（logarithmicphase），是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的代时或原生质增加一倍所需的倍增时间最短。细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀。酶系活跃，代谢旺盛。细菌数目增加与原生质总量增加，与菌液浊度增加呈正相关性

指数期特点：指数生长可以用下式表示：

Bt=B0×2nn可通过上式计算得出，将等式两侧取对数重排后得：lgBt=lgB0+nlg2

lg

Bt-lg

B0

lgBt-lg

B0

lg20.301式中：B0

为起始师细胞数目，Bt

为指数生长某个时刻t时的细胞数目，

n为世代数n==Bt0（1）繁殖代数（n）（2）生长速率常数（R）（3）代时（G）n3.322（lgx2–lgx1）R=————————=————————————————

t2–t1t2–t1

lgx2–lgx1n=————————=3.322（lgx2–lgx1）

lg21t2–t1G=————=————————————————=R3.322（lgx2–lgx1）

t2-t1n在指数生长期中，有三个参数最为重要：在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generationtime)，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doublingtime)。代时通常以G表示。例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（B0），经4h（t）后增加到49，000，000（Bt），这样，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12借助于n和t，还可以计算出不同培养条件下的代时G，

G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。代时在不同种微生物中的变化很大，另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。影响指数期微生物代时时间的因素很多，主要有：（1）菌种：不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；多数微生物的代时为1~3h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；一些细菌的代时菌名 培养基 培养温度 代时E.coli（大肠杆菌） 肉汤 37℃ 17minE.coli 牛奶 37 12.5 Enterobacteraerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶37 16~18 E.aerogenes 组合 37 29~44B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26S.lactis 乳糖肉汤 37 48Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌） 肉汤 37 23.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 792~93 Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 1200温度对微生物的代时有明显影响：E.Coli在不同温度下的代时温度（℃） 代时（分） 温度（℃） 代时（分）10 860 35 2215 120 37 1720 90 40 17.525 40 45 2030 29 47.5 77（2）培养温度：（3）营养成分：同一种细菌，在营养屋丰富的培养基中生长，其代时较短，反之较长；（4）营养物浓度：在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比；凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子（growyh-limitedfactor）。指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致、细胞成分平衡发展和生长速率恒定，故可作为代谢、生理等研究的良好材料，是增殖噬菌体的最适宿主菌龄，也是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄。（三）稳定期（stationaryphase）又称恒定期或最高生长期。此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率常数降低直至零(即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中)。细胞重要的分化调节阶段：细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物。稳定期特点：稳定期来到的原因主要是：1、营养物尤其是生长限制因子的耗尽；2、营养物的比例失调，例如C/N比值不合适等；3、酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的积累；4、pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜，等等；生产上常通过补充营养物质（补料）或取走代谢产物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡等措施延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。稳定期是以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢物为目的的一些发酵生产的最佳收获期。（四）衰亡期（decline或death

phase）在衰亡期，营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。细胞形态多样，例如会产生很多膨胀、不规则的退化形态；有的微生物因蛋白水解酶活力的增加就发生自溶；有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物；在芽孢杆菌中，芽孢释放往往也发生在这一时期；产生衰亡期的主要原因是外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。lg细胞数或产物浓度时间细胞产物I型 II型微生物生长与代谢产物形成的关系微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为：初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；次级代谢产物与微生物的生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰亡期。丝状微生物的群体生长丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中振荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。以菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。培养时间与菌丝体干重的立方根成直线关系。可分为三个阶段：1、停滞期（生长延滞期）2、迅速生长期（快速生长期）3、衰亡期（生长衰退期）三、微生物的连续培养连续培养(Continousculture）又称开放培养（openculture），在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。分批培养（batchculture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养是在研究生长曲线的基础上，通过认识稳定期到来的原因，并采取有效措施而实现的。一方面，以一定速度连续流进新鲜培养基，并立即搅拌均匀。另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。动态平衡培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。单批培养恒浊法恒化法单批培养 连续培养 时间连续流入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养（一）连续培养原理连续培养器按控制方式分按培养器的级数分按细胞状态分按用途分内控制（控制菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器单级连续培养器多级连续培养器一般连续培养器固定化细胞连续培养器实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐（二）连续培养器（三）连续培养技术1、恒化连续培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持微生物始终在低于其最高生长速率的条件下达到连续培养。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究恒化器（Chemostat或bactogen）概念：根据培养器内微生物的生长密度，借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体高密度、生长速度恒定的微生物细胞。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌液浓度不变,即浊度不变。当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。2、恒浊培养使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。恒浊器与恒化器的比较装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密度（内控制）无限制实质因子不恒定最高速率大量菌体或与菌体相平行的代谢产物生产为主恒化器培养基流速（外控制）有限制实质因子恒定低于最高速率不同生长速率的菌体实验室为主（四）连续发酵（continuousfermentation）将连续培养用于发酵，即为连续发酵。相对于单批发酵而言。SCP的生产、乙醇、乳酸、丙酮和丁醇的发酵、石油脱蜡、污水处理等应用。优点：高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；自控：便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量稳定；节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月~1年。指微生物在液体培养基中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。选取最佳培养基成分和各成分含量补料（采用逐量流加的方式进行）提高溶解氧的浓度防止有害代谢产物的生成四、微生物的高密度培养（高密度发酵）高密度培养的具体方法：应用：用基因工程菌生产多肽类贵重药物（胰岛素、白细胞介素、干扰素、生长激素等）。目前被用于高密度培养的只有大肠杆菌和酿酒酵母不同菌种和同种不同菌株间，达到高密度的水平差别很大。E.coli可达174~175g(湿重)/L，理论值可达200g/L，甚至400g/L

。第三节影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的外界因素很多,除了营养条件外,还有许多物理条件。如温度、pH、氧气等。一、温度由于微生物的生命活动是由一系列生物化学反应组成的，而这些反应受温度的影响极为明显。温度是影响微生物生长的最重要的因素之一最低生长温度最适生长温度最高生长温度不同微生物生长的温度范围在-12—100oC，每种微生物生长的温度都存在生长温度三基点。最适生长温度有时也简称“最适温度”，其意义是某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。（一）生长温度三基点

菌名 生长温度 发酵温度 累积产物温度 （℃） （℃） （℃）

Streptococcusthermophilus 37 47 37S.lactis 34 40 产细胞：25~30 产乳酸：30Streptomycesgriseus 37 28 _Corenybacteriumpekinense 32 33~35 _Clostridiumacetobutylicum 37 33 _Peniciliumchrysogenum 30 25 20以青霉素的生产为例：培养165小时采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在30℃培养提高了14.7%。分段控制方式：0~5小时，30℃；5~40小时，25℃；40~125小时，20℃；125~165小时，25℃。★不同生理生化过程的最适温度微生物不同生理活动要求不同温度最适生长温度≠发酵速度快、积累代谢产物多根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：（二）微生物生长温度类型低温型微生物（嗜冷微生物）：＜20℃（一般为15℃）。

中温型微生物（嗜温微生物）：20～45℃，室温菌约25℃，体温菌约37℃。高温型微生物（嗜热微生物）：＞45℃，一般50～60℃。

最低温度最适温度最高温度嗜热液化芽孢杆菌376070嗜热纤维芽孢杆菌506068丙酮丁醇梭菌203747植物乳杆菌103040干酪乳杆菌103040大肠杆菌103747乳脂链球菌103037嗜热链球菌2040~5053枯草杆菌1530~3755黑曲霉730~3947啤酒酵母1028401、高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。微生物对热的耐受力与以下因素有关:（1）微生物种类及发育阶段嗜热菌、有芽孢、繁殖结构、老龄菌抗热（二）高温与低温对微生物的影响（2）微生物对热的耐受力还受环境条件的影响

培养基中蛋白质含量高时、pH适宜时、含水量小时、含菌量高、热处理时间短，微生物不易死亡。

当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖停止，当微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4℃的冰箱中。当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些则并不死亡。2、低温对微生物的影响造成死亡的原因：①冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。②冻结过程造成细胞脱水。冻结速度对冰晶形成有很大影响，缓慢冻结，形成的冰晶大，对细胞损伤大；快速冻结，形成的冰晶小、分布均匀，对细胞的损伤小，因此，利用快速冻结可以对一些菌种进行冻结保藏，一般情况下在菌悬液中再加一些甘油、糖、牛奶、保护剂等可对菌种进行长期保藏。氧对微生物的生命活动有着极其重要的影响，微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:专性好氧菌好氧菌微好氧菌兼性厌氧菌耐氧厌氧菌厌氧菌(专性)厌氧菌二、氧气对微生物生长的影响五类与氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态（模式图）氧浓度对不同微生物生长的影响厌氧菌的氧毒害机制——SOD学说：厌氧菌因缺乏超氧化物歧化酶，故易被生物体内极易产生的超氧物阴离子自由基而毒害致死。产甲烷菌等都属于厌氧菌厌氧性微生物，在培养时必须隔绝空气，通常采取的措施有：用焦性没食子酸吸收氧气、抽真空、加盖覆物以及密闭容器等，或采用厌氧培养箱、发酵罐等。 H2O+1/2O22O-2·+2H+ O2+H2O2 2H2OSOD好氧生物和耐氧细菌过氧化氢酶好氧生物过氧化物酶NADH2 NAD耐氧菌各类菌所含对氧解毒酶

专性好氧菌SOD，过氧化氢酶兼性厌氧菌SOD，过氧化氢酶专性厌氧菌二种酶均无微好氧菌少量SOD耐氧菌SOD，过氧化物酶◆影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。◆改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.5～5产乙醇，在pH6.5以上产甘油、酸。◆环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。三、pH值对微生物生长影响（一）环境pH值对微生物生长的影响微生物的生长pH值范围极广，从pH<2~>10都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.0~9.0之间。微生物生长的pH值三基点：各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。（二)不同微生物对pH要求不同不同的微生物最适生长的pH值不同，根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为：

嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌耐碱微生物：许多链霉菌中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌嗜酸微生物：硫杆菌属耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌微生物种类最低pH最适pH最高pH大肠杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌黑曲霉一般放线菌一般酵母菌

1.55.03.06.0—8.06.0—7.57.0—7.55.0—6.07.0—8.05.0—6.09.0108.0

一些常见微生物生长的pH值范围同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH值要求不同。例如：丙酮丁醇梭菌

在pH值=5.5—7.0时，以菌体生长为主在pH值=4.3—5.3时，进行丙酮丁醇发酵同一种微生物由于环境pH值不同，可能积累不同的代谢产物。例如：黑曲霉pH值=2～3时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。pH值在7左右时，产物以草酸为主，只产少量柠檬酸。

几种抗生素产生菌的生长与发酵的最适pH

微生物 生长最适pH 合成抗生素最适pH灰色链霉菌 6.3~6.9 6.7~7.3红霉素链霉菌 6.6~7.0 6.8~7.3产黄青霉 6.5~7.2 6.2~6.8金霉素链霉菌 6.1~6.6 5.9~6.3龟裂链霉菌 6.0~6.6 5.8~6.1灰黄青霉 6.4~7.0 6.2~6.5（三）微生物细胞内的pH值虽然微生物生活的环境pH值范围较宽，但是其细胞内的pH值却相当稳定，一般都接近中性。这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值。微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值接近环境pH值。（四）微生物的生命活动对环境pH值的影响微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变，原因：由于有机物分解：分解糖类、脂肪等，产生酸性物质，使培养液pH值下降；分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上升由于无机盐选择性吸收：铵盐吸收（(NH4)2SO4H2SO4），pH↓硝酸盐吸收(NaNO3NaOH)，pH↑★培养过程中调节pH值的措施过酸时：加入碱或适量氮源，提高通气量。过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量。NH4+被吸收NO3+被吸收★配制培养基时调整pH值的措施第五节有害微生物的控制在周围环境中，到处都有各种各样的微生物存在着，其中是对人类有害的微生物，我们应采取有效的措施来抑制或消灭它们。物理方法包括高温、干燥、辐射、过滤等；化学方法包括消毒剂、防腐剂和化学治疗剂。灭菌（sterilization）采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。灭菌还可分杀菌（菌体虽死、形体尚存）、溶菌（菌体被杀死后，细胞自溶、裂解消失）。

消毒（disinfection）采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施，称为消毒。防腐（antisepsis）利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施，称为防腐。化疗（chemotheraphy）即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病院微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。一、几个基本概念低温：利用4℃以下的各种低温以保藏食物、药品、菌种等。缺氧：在密闭容器中加入除氧剂，如铁粉。真空保藏也是比较常用的方法。干燥：采用晒干或红外线干燥保藏粮食、食品等，或在密封条件下用吸湿剂也可达到防霉作用。高渗：通过盐渍或糖渍达到高渗。高酸度：如泡菜、酸菜等。高醇度：用酒保存食品。防腐剂：苯甲酸、山梨酸、脱氢醋酸等。防腐的措施二、常用的灭菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法1、高温灭菌（消毒）法：是最常用的物理方法。高温可引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。

（一）温度能作为物理杀菌因素的种类很多，例如高温、辐射、超声波和激光等，现在最常用的方法是高温。当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用(1)干热灭菌法（dryheatsterilization）①焚烧法或火焰灼烧法（incineration）：是将被灭菌物品在火焰中燃烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭菌等。②干燥热空气灭菌法(hot-airoven)：将物品放入烘箱内，然后升温至160℃—180℃，维持1—2小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。(2)湿热法(moistheatsterilization)：特点：温度低、时间短、灭菌效果高原因：1)菌体内含水量越高，则凝固温度越低；2)蒸汽冷凝会放出潜热；3)饱和水蒸汽穿透力强；4)湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定

性，主要破坏氢键结构。

湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：多数细菌和真菌的营养细胞：在60℃左右处理5~10分钟；酵母菌和真菌的孢子：用80℃以上温度处理；细菌的芽孢：121℃处理15分钟以上；①高压蒸汽灭菌法利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100℃以上高温灭菌的方法。方法：121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15-20min。112℃（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。115℃（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121℃。葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112℃。适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。注意事项：排净冷空气；灭菌终了，缓慢降压；灭菌结束，趁热取出物品。高压蒸汽灭菌锅利用温度进行杀菌的定量指标热死时间：在某一温度下，杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间。如：E.coli在60℃下为10min。热死温度（热死点）：在一定时间内（一般为10min），杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度。多数细菌、酵母菌、霉菌的营养细胞和病毒，在50～65℃10min即可致死。梅毒密螺旋体43℃10min即可致死。高温对培养基的影响及其防止措施高温对培养基的不利影响：▲会产生混浊或形成不溶性沉淀▲营养成分被破坏（PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）；▲色泽加深（褐变如产生氨基糖等）；▲改变培养基的pH值（通常下降0.2）；▲形成有害物质，抑制微生物生长；消除有害影响的措施

采用特殊的加热灭菌法过滤除菌法加入螯合剂影响加压蒸气灭菌效果的因素

1、灭菌物体的含菌量2、灭菌锅内排除空气的程度3、灭菌对象的pH值pH＜6.0时，微生物易死亡；pH6.0~8.0时，不易死亡。4、灭菌对象的体积5、加热与散热速度②煮沸消毒法将水加热至100℃，煮沸15min—30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的。一般用于引用水的消毒。③巴斯德消毒法（Pasteurization）：用较低的温度来杀死其中的病源微生物，这样既保持食品的营养风味，又进行了消毒该法一般是将待消毒的液体食品置于62℃处理30min，然后迅速冷却。即可达到消毒目的。适用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法。引起环境中大多数污染菌死亡的温度都在60℃以内，所以为了不影响食品的营养和风味，多采用在较低的致死温度下，稍长于致死时间的消毒方法。低温长时法(Lowtemperaturelongtime,LTLT)；

62.9℃30min处理牛奶高温瞬时（Hightemperatureshorttime,HTST):71.6℃15s处理牛奶超高温巴斯德灭菌法(Ultrapasteurization):让液体食品停留在140℃左右3-4s，急剧冷却至75℃，经匀质化后冷却至20℃。④间歇灭菌法(丁达尔灭菌法)：将待灭菌物品在80

-100℃蒸煮15-60min，冷却后搁置室温（28

-37℃）下过夜，并重复以上过程三遍以上。适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。缺点是麻烦、费时。低温——低温是通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制。冷藏法：5℃，微生物斜面菌种放置冷藏箱中可保存数周至数月而不衰竭死亡；食品保鲜冷冻法：食品工业中采用-10℃左右的冷冻温度较长时间地保藏食品；冷冻法也可用作菌种保藏，但所需温度更低，如-80℃低温冰箱、或-78℃干冰、或-80℃液氮中冷冻保存。2、低温抑菌对一种微生物来说：超过它的最高生长温度可杀死它采用它的最适生长温度可培养它低于它的最低生长温度可保存它采用滤孔比细菌还小的筛子或滤膜作成各种过滤器，当空气或液体流经筛子或滤膜时，微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧，从而达到灭菌的目的。但不能除去病毒。实验室中常用的滤器：滤膜过滤器、蔡氏过滤器、玻璃过滤器、磁土过滤器等过滤介质：醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜；以及石棉板、烧结陶瓷、烧结玻璃等。滤器孔径：常用0.22μm、0.45

μm

。应用：对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质除菌。（二）过滤除菌法不耐热的液体培养基的灭菌干燥缺水的环境会抑制微生物的生长，甚至导致微生物的死亡.一般微生物的营养体对干燥敏感，但芽胞或霉菌、放线菌的孢子较耐干燥，所以通常用沙土管法来保存有孢子的菌种，真空冻干法可保存细菌、病毒、立克次氏体等，干燥法还可保存食品。渗透压：低渗溶液一般对菌体影响不大，但对原生质体可造成破坏；高渗溶液则能抑制大多数微生物的生长（耐渗性微生物除外）。所以通常用盐或糖加工蔬菜、肉类和水果等。相同含量的盐、糖、蛋白质所形成的溶液渗透压为:盐>糖>蛋白质对于一般微生物来说，在含盐5%~30%或含糖30%~80%的高渗条件下可抑制或杀死某些微生物。(三)干燥和渗透压细菌中的嗜盐菌：能在15%~30%的盐溶液中生长，主要分布在盐湖、死海、海水和盐场及腌渍菜中。又分为：低嗜盐菌：能在2%~5%盐溶液中生长中嗜盐菌：5%~20%极端嗜盐菌：20%~30%高糖环境下生长的微生物：

花蜜酵母菌和某些霉菌能在60%~80%的糖溶液中生长产甘油的耐高渗酵母能在20%~40%的糖蜜中生长辐射：是能量通过空间传递的一种物理现象。与微生物有关的辐射：电磁辐射：可见光、紫外光，电离辐射：χ、γ、β射线。(四）辐射1、可见光：波长在400—800nm的电磁辐射为可见光。大部分微生物不需要光，少数菌需要光作为能源。一般来讲，可见光对大多数化能微生物没有影响，但是，太强或连续长时间照射也会导致微生物死亡（光氧化作用）。2、紫外线（ＵＶ）波长在100—400nm的电磁辐射为紫外线。紫外线杀菌或诱变原理：紫外线作用于DNA

，使其产生胸腺嘧啶二聚体，引起DNA结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成微生物变异或死亡。紫外线会使空气中的分子氧变成臭氧，臭氧释放的原子氧有杀菌作用。其中波长在260—280nm处的紫外线杀菌力最强。主要因为核酸（DNA、RNA）的吸收峰为260nm，蛋白质的吸收峰为280nm。光复活现象：经紫外线照射的微生物，在可见光下，光可以激活DNA修复酶，该酶能修复DNA上的损伤，使微生物的突变率或死亡率下降。微生物对紫外线的抵抗力与以下因素有关：照射时间：照射时间长，死亡率高。照射强度：照射强度大，死亡率高。微生物种类及生长阶段：革兰氏阳性菌比阴性菌抗性强；多倍体比单倍体抗性强；孢子和芽孢比营养细胞抗性强；干燥细胞比湿润细胞抗性强。应用：由于穿透力差，只适用于物体表面以及空气、水的消毒杀菌，也用于诱变育种。

χ、γ、β射线，波长短，能量高，有较强的杀伤力。作用原理：可引起水和其他物质的电离，产生游离基，使核酸、蛋白质或酶发生变化，造成细胞损伤或死亡。特点：穿透力强，非专一性，作用于一切细胞成分，对所有生物均有杀伤作用。应用：用于杀菌或菌种诱变。一般低剂量的电离辐射（如500伦琴），可以促进微生物的生长，或诱发变异，高剂量（如10万伦琴）则可引起微生物的死亡。r射线是由60Co发出的高新辐射，电离作用和穿透力都很强，常用于食品灭菌。3、电离辐射微波：微波的范围在915—2450MHz/s之间。机理：微波产生热效应，使蛋白质、酶等物质变性，导致微生物死亡。

特点：加热均匀，热能利用率高、加热时间短。应用：食品消毒、灭菌。（五）微波与超声波超声波：每秒钟振动在1600以上的声波。机理：引起膜破坏，细胞破裂，内涵物逸出。

应用：破碎细胞，提取胞内物质（代谢产物、酶等）杀菌,超声波杀菌效力大小与频率、强度、处理时间等多种因素有关。三、常用的化学抑菌方法消毒剂:可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用的化学试剂.—主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。防腐剂:可以抑制或阻止微生物生长，但对人体或动物体的毒性较低的化学药剂.——用于肌体表面，如皮肤、粘膜、伤口等处防止感染，也有的用于食品、饮料药品的防腐作用。☆但现时消毒剂和防腐剂间的界限已并不很严格.（一）消毒剂和防腐剂1、消毒防腐剂的作用机理一般有下列三种方式:①使微生物蛋白质凝固变性,发生沉淀.如酒精等.②破坏菌体的酶系统,影响菌体代谢.如过氧化氢等.③降低微生物表面张力,增加细胞膜的通透性,使细胞发生破裂或溶解.如来苏儿等酚类物质.2、消毒剂杀菌的规律

低浓度时，会对微生物的生命活动起刺激作用，随浓度的增加，相继出现抑菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。3、表面消毒剂的相对杀菌强度——石炭酸系数（P.C.）在一定时间内，被试药剂杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸最高稀释度之比。时间：10min、供试菌：Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）

如：P.C.=300/100=3类型名称及使用方法作用原理应用范围醇类70%—75%乙醇脱水、蛋白质变性皮肤、器皿醛类0.5%—10%甲醛2%戊二醛（pH=8）蛋白质变性房间、物品消毒（不适合食品厂）酚类3%—5%石炭酸2%来苏儿3%—5%来苏儿破坏细胞膜、蛋白质变性地面、器具皮肤地面、器具氧化剂0.1%高锰酸钾3%过氧化氢0.2%—0.5%过氧乙酸氧化蛋白质活性基团，酶失活皮肤、水果、蔬菜皮肤、物品表面水果、蔬菜、塑料等4、常用的消毒防腐剂及其应用类型名称及使用方法作用原理应用范围重金属盐类0.05%—0.1%升汞2%红汞0.1%—1%硝酸银0.1%—0.5%硫酸铜蛋白质变性、酶失活变性