第06章 免疫沉淀试验

临床免疫学检验技术

第六章免疫沉淀试验

秦雪目录第一节免疫沉淀试验的基本原理第二节液相免疫沉淀试验第三节凝胶内免疫沉淀试验第四节免疫沉淀试验的临床应用第五节临床常用免疫沉淀试验试剂方法特点第六节影响免疫沉淀试验的主要因素第一节免疫沉淀试验的基本原理一二三免疫沉淀试验的特点免疫沉淀试验的分类

基本原理

第一节免疫沉淀试验的基本原理一、基本原理：沉淀反应将可溶性抗原与相应抗体置于温度、酸碱度适宜的一定电解质溶液中，两者按适当比例形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环，并根据所形成的沉淀物计算待测抗原或抗体的含量。

二、免疫沉淀试验的分类

液相沉淀试验

凝胶内沉淀试验

环状免疫沉淀试验絮状免疫沉淀试验透射免疫比浊试验散射免疫比浊试验免疫扩散试验免疫电泳技术

第一节免疫沉淀试验的基本原理三、免疫沉淀试验的特点1.阶段性免疫沉淀试验分两个阶段，第一阶段为抗原抗体特异性结合，形成不可见的可溶性免疫复合物；第二阶段则形成可见的免疫复合物。2.特异性免疫沉淀试验为抗原与相应抗体发生特异性结合反应的过程，因此具有特异性。3.抗原性质参与免疫沉淀试验的抗原必须为可溶性抗原。4.抗体的选择多克隆抗体与抗原多个表位结合，易形成沉淀，故非常适用于免疫沉淀试验；单克隆抗体只与抗原一个表位结合，不易形成交联。若抗原表面有两个以上相同的表位，单克隆抗体也可用于免疫沉淀试验。第一节免疫沉淀试验的基本原理第二节液相免疫沉淀试验一二免疫浊度测定

絮状免疫沉淀试验液相免疫沉淀试验（liquidphaseimmunoprecipitationtest）是指可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的液相介质中反应，形成肉眼可见的沉淀物。根据实验方法和所形成的免疫复合物呈现的沉淀现象的不同，可将液相免疫沉淀试验分为环状免疫沉淀试验、絮状免疫沉淀试验和免疫浊度测定。第二节液相免疫沉淀试验一、絮状沉淀试验（flocculation）是可溶性抗原与相应抗体特异结合，在电解质存在的条件下，形成肉眼可见的絮状沉淀物。此方法受抗原抗体比例的影响非常明显，常用来作测定抗原抗体反应的最适比例。有抗原稀释法、抗体稀释法和方阵滴定法三种操作方法。第二节液相免疫沉淀试验二、免疫浊度测定（immunoturbidimetry）原理：可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者在比例合适和增浊剂作用下，可快速形成较大的免疫复合物，使反应液出现浊度；当反应液中保持抗体过量且浓度固定时形成的免疫复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度也随之增加，即待测抗原量与反应液的浊度成正相关；与标准曲线比较，即可计算出待测抗原的含量。第二节液相免疫沉淀试验（一）透射免疫比浊试验1.原理可溶性抗原与相应抗体在一定缓冲液中结合形成免疫复合物，使反应液浊度发生改变，当一定波长的光线通过反应液时，被其中的免疫复合物反射、吸收而引起透射光减少，可用吸光度表示，吸光度与免疫复合物的含量成正比，在保持抗体过量的条件下，吸光度与抗原量成正比。2.方法学评价（1）优点：操作简便、快速、结果准确性较好、能用全自动或半自动仪器进行测试、敏感度比单向免疫扩散试验高5倍～10倍。（2）缺点：1）抗体用量大；2）耗时长；3）抗原或抗体极度过剩时易导致免疫复合物分离；4）不宜用于药物半抗原的检测。第二节液相免疫沉淀试验（二）散射免疫比浊试验1．原理利用抗原抗体在液相中特异性结合后产生一定大小的免疫复合物，当一定波长的光通过该反应液遇到免疫复合物时光线发生散射现象，散射光的强度与免疫复合物的含量和散射夹角成正比，与入射光波长成反比。当散射夹角和入射光波长一定时，散射光的强度与免疫复合物的含量成正比，当反应体系中保持抗体过量时，形成的免疫复合物含量又与抗原含量成正比。应用标准品制作标准曲线，通过检测散射光强度即可计算出待测标本中的抗原含量。根据散射光检测时间及检测方式的不同，散射免疫比浊试验又分为终点散射比浊试验和速率散射比浊试验两种。第二节液相免疫沉淀试验2.终点散射比浊试验所谓“终点”是指在抗原抗体反应达到平衡时测定散射光强度。在抗原抗体反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，计算出的结果会产生较大的误差。散射免疫比浊试验是避开了抗原抗体反应的不稳定阶段，在抗原抗体反应的最佳时段读数，将误差降到最低，且必须在免疫复合物相互聚合形成絮状沉淀前完成测定，否则光散射值降低，得出偏低的结果。终点散射比浊试验是在免疫反应进行到一定时间时测量其浊度，故亦称定时散射比浊试验。第二节液相免疫沉淀试验2.终点散射比浊试验终点散射比浊试验是在抗原抗体反应达到平衡时测定散射光强度。其检测敏感度较高，达μg/L水平，高于透射免疫比浊试验，但低于速率散射比浊试验，可用自动化分析；在抗原抗体反应的第一阶段，反应时间较长，不合快速检测，计算时需减去本底值，在微量测定时，本底的干扰会影响准确测定。第二节液相免疫沉淀试验3.速率散射比浊试验所谓“速率”是指单位时间内抗原与抗体反应的速度或免疫复合物形成的量，而不是免疫复合物累积产生的量。抗原与抗体混合后瞬间即发生反应，在抗体过量的情况下，抗原抗体反应速度由慢到快，在单位时间内产生的免疫复合物不断增多，随后逐渐减慢，在此变化过程中，在某一时间点抗原抗体反应速率最快，单位时间内产生的免疫复合物含量达到最大值，散射光强度变化亦最大，此即为速率峰。速率峰的峰值与抗原浓度成正相关。选取速率最大，且与被测抗原浓度变化呈线性关系的速率峰值，制作剂量-反应曲线，即可计算出被测抗原的浓度。速率散射比浊试验具有速度快、灵敏度和精密度高、特异性强、稳定性好、检测范围宽、自动化程度高、节省试剂等优点；但仪器试剂比较贵、对抗体的质量要求较高。第二节液相免疫沉淀试验（三）胶乳增强免疫浊度测定将抗体吸附在大小合适、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波长范围内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时透射光减少，减少的程度与胶乳颗粒凝聚程度成正比，同时与待测抗原含量成正比。通过检测光强度变化即可计算出待测样品中抗原的含量。第二节液相免疫沉淀试验第三节凝胶内沉淀试验一二三免疫电泳技术双向免疫扩散试验

单向免疫扩散试验凝胶内沉淀试验（gelphaseprecipitation）利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。凝胶内沉淀试验可分为：单向免疫扩散试验双向免疫扩散试验第三节凝胶内沉淀试验一、单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验：先将一定量的抗体混于琼脂凝胶中，使待测的抗原溶液在琼脂内由局部向周围自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环，环的直径或面积的大小与抗原含量呈正相关。根据试验形式可分为试管法和平板法两种，试管法因沉淀环不易观察及定量，目前较少应用。第三节凝胶内沉淀试验一、单向免疫扩散试验（平板法）倾注平板→打孔→加样→放置37℃→24～48h观察沉淀环第三节凝胶内沉淀试验一、单向免疫扩散试验（平板法）抗原量与环直径关系的两种计算方法1.Mancini曲线：大分子抗原（IgM）长时间扩散＞48h常数K＝C∕d2普通坐标纸曲线（C为抗原浓度，d为沉淀环直径）第三节凝胶内沉淀试验2.Fahey曲线：小分子抗（IgG,IgA）扩散时间较短24h常数K＝logC∕d半对数坐标纸曲线（C为抗原浓度，d为沉淀环直径)第三节凝胶内沉淀试验一、单向免疫扩散试验（平板法）抗原量与环直径关系的两种计算方法二、双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验将抗原和抗体加在同一琼脂板对应孔中，各自向对方扩散，在浓度比例恰当处形成沉淀线，观察沉淀线的位置、形状及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。根据试验形式可分为试管法和平板法。第三节凝胶内沉淀试验二、双向免疫扩散试验（平板法）平板法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一。基本步骤是：打孔→在各对应孔中加入抗原或抗体→湿盒37℃18h～24h→观察沉淀线。第三节凝胶内沉淀试验第三节凝胶内沉淀试验二、双向免疫扩散试验（平板法）

应用：

1.判断抗原或抗体的存在以及估计相对含量

2.分析抗原或抗体相对分子量

3.分析抗原的性质第三节凝胶内沉淀试验4.抗体效价的滴定5.鉴定抗原或抗体纯度第三节凝胶内沉淀试验三、免疫电泳技术免疫电泳技术（immunoelectrophoresistechnique）是电泳分析与免疫沉淀试验相结合的产物，是直流电场作用下的凝胶扩散试验，是将抗原抗体反应的高度特异性与电泳技术的高分辨率及快速、微量等特性相结合的一种免疫化学技术。优点：①加快了沉淀反应的速度；②抗原抗体的扩散方向固定集中，提高了灵敏度；③可先利用蛋白组分所带电荷的不同而将其进行分离，再分别与抗体反应。分类：对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳、交叉免疫电泳和自动化免疫电泳等多项实验技术。第三节凝胶内沉淀试验

双向免疫扩散+电泳技术（负极）抗原等电点低，带较强的负电荷，分子量小，在电场中向正极移动（正极）抗体等电点偏高，带负电荷较少，且分子量较大，在电渗作用下，抗体移向负极抗原抗体浓度最适比处形成沉淀线比双向免疫扩散法灵敏度提高8倍～16倍

第三节凝胶内沉淀试验（一）对流免疫电泳

原理：（一）对流免疫电泳结果分析：1.无沉淀线出现说明无相应的抗原2.沉淀线出现于抗原抗体孔中间，说明两者比例适合3.沉淀线接近抗原孔，表明抗体浓度＞抗原，反之，则是抗体浓度＜抗原浓度对流免疫电泳结果图第三节凝胶内沉淀试验（二）火箭免疫电泳单向免疫扩散与电泳相结合的定量检测技术原理：将抗体混合于琼脂中，电泳时，抗体不移动，抗原由负极向正极泳动，并随抗原浓度的减少，抗原泳动的基底区也逐渐变窄，抗原抗体免疫复合物形成的沉淀线也越来越窄，形成一个火箭状的不溶性复合物沉淀峰。当琼脂中的抗体浓度保持不变时，沉淀峰的高度与抗原量呈正比例关系，用已知浓度标准抗原作对照，制作标准曲线，即可根据沉淀峰的高度从标准曲线中计算出待测抗原的浓度。反之，固定抗原的浓度，便可检测抗体的含量（称为反向火箭电泳）。第三节凝胶内沉淀试验（二）火箭免疫电泳结果判断：抗体浓度不变→沉淀峰高度与抗原量呈正相关抗原浓度不变→沉淀峰高度与抗体量呈正相关（反向火箭电泳）绘制标准曲线，就可根据沉淀峰的高度在标准曲线中计算出待测样品浓度。第三节凝胶内沉淀试验（二）火箭免疫电泳①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本第三节凝胶内沉淀试验（三）免疫电泳区带电泳＋双向扩散基本原理：先将蛋白质抗原在凝胶中作区带电泳，根据其所带电荷、分子量和构型不同分成不可见的若干区带，然后，沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清，进行双向扩散，两者比例适合处形成弧形沉淀线。通过对沉淀线的数量、位置和形态与已知标准抗原抗体生成的沉淀线比较，即可对待测样品中所含成分的种类和性质进行分析。应用：分析纯化抗原和抗体的成分。正常异常免疫球蛋白的识别与鉴定。第三节凝胶内沉淀试验免疫电泳流程图第三节凝胶内沉淀试验（三）免疫电泳免疫电泳结果示意图第三节凝胶内沉淀试验（四）免疫固定电泳区带电泳+沉淀反应原理：先将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上经区带电泳分离，再将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清加在凝胶表面的泳道上，经孵育后，固定剂和抗血清在凝胶内渗透并扩散，抗原抗体直接发生沉淀反应，洗脱游离的抗体，形成的抗原抗体复合物则保留在凝胶中。经漂洗和染色，参考泳道和抗原抗体沉淀区带被着色，根据电泳移动距离分离单克隆组分，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。最大的优势：分辨率强，敏感度高，操作周期短，结果易分析。第三节凝胶内沉淀试验（四）免疫固定电泳左图为IgGκ型，中图为IgGλ型，右为正常

第三节凝胶内沉淀试验（四）免疫固定电泳应用：用于鉴定迁移率相近的蛋白和M蛋白，免疫球蛋白轻链，尿液、脑脊液等微量蛋白，游离轻链，补体裂解产物等，目前已作为常规检测。临床最常用于M蛋白的鉴定。第三节凝胶内沉淀试验（五）交叉免疫电泳区带电泳+火箭免疫电泳定量检测技术应用：适用于比较各种蛋白组分，定性分析蛋白质遗传多态性、微小异质性、裂解产物和不正常片段等。第三节凝胶内沉淀试验（六）自动化免疫电泳电泳系统（自动化电泳仪）光密度扫描系统+优点：分辨率高、重复性好第三节凝胶内沉淀试验第四节免疫沉淀试验的临床应用1.经典的沉淀反应均可用于抗原抗体性质、效价、纯度及相对分子质量和浓度的分析2.免疫浊度法目前主要用于蛋白质的测定，如血液中的免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ轻链、λ轻链，补体C3、C4，血浆蛋白，C-反应蛋白，类风湿因子等；尿及脑脊液微量蛋白和半抗原（激素、毒物、治疗性药物等；还可用于血浆药物浓度的测定

第四节免疫沉淀试验的临床应用3.对流免疫电泳与火箭免疫电泳技术因存在电渗作用，目前已不推荐使用4.免疫电泳扩散时间长，影响因素多，结果较难分析5.免疫固定电泳技术因分辨力强，敏感度高，结果易于分析，现常用于鉴定迁移率相近的蛋白和M蛋白，免疫球蛋白轻链，尿液、脑脊液等微量蛋白，游离轻链，补体裂解产物等，临床最常用于M蛋白的鉴定与分型，并已列入临床实验室的常规检测工作第五节临床常用免疫沉淀试验试剂方法特点一、在全自动生化分析仪中的应用（一）单试剂单波长法（二）单试剂双波长法（三）双试剂单波长法（四）双试剂双波长法二、在血液凝固分析仪中的应用三、在半自动电泳仪中的应用四、在特种蛋白免疫分析仪中的应用第六节影响免疫沉淀试验的主要因素一二反应环境因素

抗原抗体自身因素一、抗原抗体自身因素（一）抗原因素1.抗原的理化性状参与免疫沉淀试验的抗原必须为可溶性抗原，否则无法形成肉眼可见的沉淀现象2.抗原表位与种类天然抗原常为多价，参与免疫沉淀试验的抗原表面相同表位越多，越容易与相应抗体相互交联成立体网格状聚集体，出现肉眼可见的沉淀物第六节影响免疫沉淀试验的主要因素（二）抗体因素1.抗体的来源家兔等大多数动物的免疫血清较人和马的免疫血清具有更宽的等价带，与相应可溶性抗原结合更易出现可见的沉淀物。而单克隆抗体一般不适合用于免疫沉淀试验，大多数情况下都是用多克隆抗体。2.抗体的质量用于免疫沉淀试验的抗