毒性作用机理

免疫毒理

免疫毒理学是毒理学与免疫学间的边缘学科，也是毒理学的一个新分支。本学科主要是研究外源性化学物质及物理因素对人和实验动物的免疫系统产生不良影响及影响机理。免疫应答是宿主的一个重要防护与调节机理。由于免疫系统受损，就能大大增加传染病的发生率．因此会间接影响动物的生命。本来很多外源性化学物质都是一些小分子的物质，是半抗原，并不能引起免疫应答，但当器官损伤以后，它和损伤的组织成分相结合就可能产生抗原性，引起免疫病理性损伤。对免疫功能检测有助于对外源性化学物质所造成损害的临床表现及病理过程有进一步的了解。免疫毒理学的研究还有助于我们了解毒物损害的生物学机理。免疫应答具有高度的选择性和特异性，并且由多种免疫细胞和细胞因子参与完成。现在已经可以利用体外培养各种免疫细胞的方法，在培养液里加入各种外源性化学物质，有助于了解这些外源性化学物质作用的部位，并提供有关外源性化学物质与生物效应之间作用性质方面的资料。

免疫毒理外源性化学物质对免疫系统作用的特点

1．反应灵敏很多外源性化学物质对免疫系统的不良反应的剂量往往低于它们的毒性剂量。

2．反应的复杂性外源性化学物质对免疫系统影响的复杂性，主要表现在免疫反应的双重性和作用的选择性。机体对某种化学物可出现免疫增强或免疫抑制两种效应，它取决于剂量大小、接触途径及检测时间。不同的外源性化学物质作用于免疫反应的不同环节。

免疫毒理具有免疫毒性的外源性化学物质

(1)抗肿瘤药物。环磷酰胺、氮芥、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、放线菌素、多柔比星等；

(2)重金属，有机金属铝、镉、镍、铬、甲基汞、二氯二N-辛基锡、氯化二丁基锡、亚砷酸钠、砷酸钠和三氧化二砷等；

(3)农药，DDT、狄氏剂、西维因、虫螨威、甲基对硫磷、代森锰、氯丹等；

(4)卤代烃，多氯联苯、多溴联苯、三氯乙烯、氯仿、五氯酚、邻苯基酚等；

(5)其它，如苯并芘、甲基胆蒽、已烯雌酚、苯等。引起自身免疫的外源性化学物质有：乙酰唑胺、抗惊厥药、氯噻唑、异烟肼、甲基多巴、普萘洛尔、利福平、水杨酸、氯乙烯等。·

引起过敏反应的外源性化学物质有抗氧化剂、抗生素(新霉素、头孢菌素、青霉素等)、氯胺T、二异氰酸酯、二氯酚、乙二胺、甲醛、金属(Pt、Ni、Be、Hg)等。免疫毒理外源性化学物对免疫功能影响的表现1．使免疫功能受到抑制或产生免疫缺陷很多化学物质可对免疫功能包括体液免疫和细胞免疫功能产生抑制作用。例如铅能损伤体液免疫和细胞免疫。不是所有的化学物质都引起免疫抑制。如许多金属对免疫功能产生抑制作用，但是硒可以增强免疫反应。

2．改变宿主的防御机理，降低机体抵抗力机体在接触外源性化学物质后，可以改变其对细菌、病毒、寄生虫及可移植肿瘤和自发肿瘤的抵抗力。一般来说，细胞介导免疫或体液免疫严重抑制可引起宿主对一些感染因子敏感性增加，抵抗力下降。免疫毒理3．产生变态反应机体受抗原刺激后，产生的异常的体液或细胞免疫反应导致生理功能紊乱或组织损伤，称为变态反应。化学物质引起的过敏反应有以下几个特点：①反应表现不同于该物质的一般毒性反应，组织病变不同于该物质的中毒性变化，而是变态反应性炎症；②初次接触某种化学物质后，经过1-2wk再次接触同一物质，反应即可出现③不完全遵循毒理学的剂量-反应的规律，很小的剂量进入体内即可致敏，再接触小剂量即可出现症状。依过敏反应出现的快慢，抗体是否存在，把变态反应分为以下4型：

(1)第1型速发型或反应类型。I型变态反应是IgE介导的变态反应。产生支气管哮喘，皮肤可出现红肿、荨麻疹等，作用于胃肠道则出现呕吐、腹痛、腹泻等症状。免疫毒理(2)第Ⅱ型细胞毒型或溶细胞型。Ⅱ型变态反应是抗体(IgG或IgM)引起带抗原的组织细胞的损伤或功能障碍。IgG或IgM抗体与机体细胞(靶细胞)表面的抗原结合，通过活化补体、巨噬细胞吞噬或K细胞的抗体依赖细胞毒作用引起细胞的破坏死亡。靶细胞有红细胞、粒细胞、血小板、肾小球血管基底膜、肝细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞以及一些内分泌细胞等.(3)第Ⅲ型免疫复合物型。Ⅲ型变态反应是由于抗原抗体复合物(免疫复合物)在组织中沉积而引起的炎症反应，炎症反应涉及补体的活化和中性粒细胞的浸润，释放出许多水解酶，并造成组织损伤。这类变态反应较常见于感染、药物治疗等弓[起的免疫复合物病。如青霉素、磺胺引起的“血清病”。(4)第IV型迟发型或细胞免疫型。IV型变态反应是由免疫的TD或TK细胞与特异抗原的反应而引起组织损伤。表面具有特异性受体的致敏淋巴细胞再次与抗原相遇，引起细胞增殖，其中TD细胞可释放淋巴因子，吸引和激活非特异性的巨噬细胞。由于细胞的增殖和浸润，可诱发迟发型变态反应。

免疫毒理对免疫功能影响的机理化学物质免疫系统直接作用免疫系统间接作用

作用细胞(1)营养障碍非特异免疫特异免疫(2)内分泌紊乱巨噬细胞B细胞(3)组织损伤而成抗原T细胞为自身抗原

K细胞

NK细胞

免疫毒性作用免疫亢进免疫抑制

过敏性疾病自身免疫感染癌症免疫毒理免疫毒理研究方法：

由于免疫系统的复杂性，参与免疫应答的器官不是单一的，参与免疫反应的细胞也是多种多样的，因此想要确定一个外源性化学物质对免疫功能的影响，决不是用一个实验就能说明的，需要进行一组实验。1979年美国国家环境科学院(NIEHS)提出了一个确定免疫功能变化的筛选方案。由于这个方案包括的内容很广，测试项目太多，因此他们又提出了一个最低的筛选方案。免疫毒理外源性化学物质免疫毒性评价的基本检测项目

项目检测内容病理毒性血液学指标一白细胞计数及分类脏器重量一体重、脾、胸腺、肝、肾、脑宿主抵抗力对植入同系基因肿瘤细胞的易感性LD10—20

迟发型皮肤过敏反应给予胸腺依赖抗原后的放射测定淋巴细胞功能有丝分裂原(PHA、ConA、LPS)刺激成淋巴细胞化的作用体液免疫免疫球蛋白定量(IgG、IgM、IgA)

对羊红细胞(SRBC)的抗体空斑反应免疫毒理免疫毒理研究方法脏器重量、细胞学、组织病理学和免疫化学检查体液免疫功能细胞免疫功能淋巴细胞增值反应巨噬细胞功能宿主抵抗力免疫毒理1.脏器重量、细胞学、组织病理学和免疫化学检查试验动物接触外源性化学物质后，对免疫系统的毒性表现为淋巴器官重量或组织学的变化，淋巴组织和骨髓的细胞在质和量上的变化，外周血白细胞数目的改变，因此在任何免疫毒性的评价中检测胸腺、脾脏、淋巴结的重量是很重要的。对淋巴气管和骨髓学的检查也是很有力的手段。淋巴器官的常规组织病理学检查在评价外源性化学物质的免疫毒性是十分有用的，因为脾脏和淋巴结的结构可以分为依赖胸腺区和不依赖胸腺区，通过组织病理学检查就能获得外源性化学物质对T、B淋巴细胞影响。免疫毒理体液免疫功能评价化学物质对体液免疫功能的影响的方法：a.抗体滴度测定（免疫扩散、补体结合、血清中和、血凝、被动血凝、放射免疫分析、酶免疫吸附分析等）b.抗体形成细胞（PFC）c.B细胞受体（Fc及补体受体）免疫毒理

琼脂单向扩散法测定血清免疫球蛋白的含量，是一种不很敏感的但却很常用的方法，在使用免疫板前只需用标准血清绘制出一条标准曲线，根据标准曲线查出血清中的Ig的含量，该方法只适用于测定血清中IgG、IgA、IgM的含量。免疫毒理目前测定血清抗体的滴度有两种比较灵敏的方法：

1.放射免疫分析（RadioImmunoassay,RIA）

2.酶联免疫吸附测定法（ELISA）

ELISA法可测定抗原、半抗原或抗体，该方法灵敏高、重复性好，适合于大规模的筛选。免疫毒理

PFC（PlagueFormingCell）,又称溶血空斑试验或空斑形成细胞试验，是检测外源性化学物质引起的体液免疫功能的改变的灵敏的最常用的方法。

PFC检查方法的原理是在体外创造一种条件，将抗原免疫鼠脾制成脾细胞悬液，在半固体凝胶介质种与羊红细胞（SRBC）混合，在平皿或玻片上制成薄层，37°C孵育1.5～2小时后加入补体，由于靠近分泌特异性抗体（淋巴细胞）的靶细胞周围的SRBC被抗体致敏，因而激活了补体，形成溶血空斑，一个空斑代表一个抗体形成细胞。免疫毒理细胞免疫功能细胞免疫功能主要是由T细胞完成，细胞免疫担负着迟发型变态反应、移植排斥、肿瘤免疫等。测定细胞免疫功能的方法主要有：整体法（迟发型变态反应、移植物抗宿主反应和皮肤移植排斥反应等）和体外法（淋巴细胞增值、T细胞细胞毒性及淋巴因子的产生）。该方法的原理：当致敏的T细胞再次接触相应的抗原后，就能引起局部的致敏淋巴小释放出多种淋巴因子，导致发生以单核细胞浸润为主的炎症，表现为皮肤的红肿硬结，这种反应一般在抗原注射后24～48小时出现。免疫毒理

对人测迟发型变态反应可采用皮试法，该方法种所用的抗原有特异型病原微生物性抗原，也称回忆抗原，如结核菌素（OT）等，还有非特异性抗原，如二硝基氯苯及PHA等。该方法是用硬结的纵横直径平均值判断结果。对试验动物的迟发型变态反应，可以用各种放射免疫分析法定量测定，该方法比皮试法灵敏。常用的抗原有KLH、PPD、BSA、BGG、SRBC等，对小鼠一般用KLH，大鼠用PPD。钥孔戚血蓝素(Keyholelimpethemocyanin,KLH）载体牛γ球蛋白（BGG）

免疫毒理淋巴细胞增殖反应淋巴细胞增殖试验是一个比较简单、重复性好，用来测定T细胞和B细胞功能活性的方法。

1960年Nowell发现，植物血凝素（PHA）和淋巴细胞在一起体外培养，数日后可看到明显肥大型母细胞，出现分裂旺盛，就是淋巴细胞转化试验。免疫毒理淋巴细胞增值试验常用的培养液有199、RPMI-1640.

刺激淋巴转化因子有特异和非特异两种。非特异的刺激物有植物提取物、细菌产物、抗体、各种化学物质等。常用的有植物血凝素、刀豆蛋白（ConA），主要刺激T细胞；美洲商路（PWM）、脂多糖（LPS）,主要刺激B细胞。免疫毒理淋巴细胞增殖试验检测方法包括形态学方法和同位素方法。形态学方法比较简单，不需要特殊仪器，可在光学显微镜下观察，因为判断母细胞是按照形态学标准，该方法客观性较差。液体闪烁测定法能客观反映淋巴细胞转化情况，但需要有同位素标记的胸腺嘧啶核苷和测3H的液闪仪。免疫毒理巨噬细胞功能巨噬细胞在免疫反应中起很重要的作用:a.有非特异吞噬功能b.细胞免疫和体液免疫，巨噬细胞的功能c.吞噬作用、胞内杀伤d.抗原摄取和处理e.产生干扰素及对感染细胞或恶变细胞的融解作用。测定方法：体内对颗粒状异物清楚率、体外对颗粒的吞噬作用、胞内杀灭细菌的能力、对肿瘤细胞生长抑制的能力及某些酶的测定来评价。免疫毒理巨噬细胞功能测定方法：

a.体内对颗粒状异物清楚率

b.体外对颗粒的吞噬作用

c.胞内杀灭细菌的能力

d.对肿瘤细胞生长抑制的能力

e.某些酶的测定来评价。免疫毒理宿主抵抗力机体接触化学物质后，可改变其对细菌、病毒、寄生虫及可移植肿瘤和自发肿瘤的抵抗力。一般来说，B细胞缺损的机体对细菌敏感性升高，T细胞缺损的机体对病毒。寄生虫、肿瘤敏感性升高。检测宿主抵抗力是在整体动物身上进行的试验，可将体内外各项免疫功能测定结果之间以及它们与整体间相互联系作全面的解释。检测试验主要有

a.对病原体的抵抗试验

b.肿瘤细胞攻击试验免疫毒理对病原体的抵抗试验本试验是用啮齿类动物做感染动物，由他们对传染原抵抗力不同来判定化学物质的免疫毒性。试验中选用传染原是需考虑的因素：

a.对人类或其他动物的危险性

b.动物是否易感

c.产生的病变是否有重复性

d.机体防御机理中是否需要B、T细胞及巨噬细胞参与

e.感染过程中是否有易于观察和判断的指标

f.动物感染的途径和感染后发病机理应与人类疾病相似

g.传染原的接种量不易过多，以免压抑宿主的免疫系统。免疫毒理常用的宿主抵抗力检测表病原体检测终点防御机理李斯特菌在攻击后14天的死亡率平均存活时间CMI、巨噬细胞链球菌平均存活时间AMI、中性粒细胞非特异型免疫流感病毒平均存活时间AMI、干扰素单纯疱疹性病毒I型和II型在攻击后14天的死亡率平均存活时间CMI旋毛虫在感染后14天检测对幼虫的驱除CMI、AMI免疫毒理对病原体的抵抗试验1.病毒易感性测定2.细菌易感性测定3.对寄生虫抵抗力的测定免疫毒理对病原体的抵抗试验病毒易感性测定：动物对病毒感染抵抗粒的改变是评定化学物质是否有免疫毒性最适合的方法，因为病毒感染可能是人类最常见的病因之一。病毒感染的结果取决于这种病毒的毒力、靶器官的易感性和宿主的免疫功能。最常用的病毒有脑心肌炎病毒（EMC）、单存疱疹性病毒（HSV）和流感A型病毒（FLU）等。免疫毒理对病原体的抵抗力试验2.细菌易感型测定：常用的细菌有李斯特细菌和绿脓杆菌。细菌在胰蛋白酶肉汤内37°C培养过夜后，在分光光度计上比浊定量（540nm），然后从标准曲线查知细菌数，给正常对照组和试验组分别静脉注射一定量的细菌后，逐日观察发病和死亡情况，共观察14天。免疫毒理对病原体的抵抗试验3.对寄生虫的抵抗力的测定：通常采用两种寄生虫即毛线虫和月原虫。人体和小鼠通过抗体和淋巴细胞的协同作用抵御毛线虫感染，无胸腺小鼠对毛线虫的驱除能力低弱。免疫毒理肿瘤细胞攻击试验本试验是应用纯系小鼠观察机体对同系基因的肿瘤细胞的抵抗力，攻击所用的肿瘤量是使10～20％正常动物发生肿瘤（TD10-20）,观察指标有肿瘤发生率、死亡率、发生肿瘤的平均潜伏期、肿瘤大小、结节数目以及平均死亡时间等。眼睛毒理毒性作用部位和类型1.角膜角膜比较娇嫩，易受外源性化学物质的毒性作用如酸碱易损害角膜、有机溶剂如丙酮、己烷和甲苯会溶解脂肪损害角膜上皮细胞、汽车废气的光化学反应物质刺激角膜感觉神经末梢致流泪；而且有许多化学物质在非局部接触时也能影响角膜，如阿的平、氯喹和氯丙嗪，可经过眼泪或通过血水屏障影响角膜，但仅在大剂量下影响人类。眼睛毒理2.虹膜、房水和睫状体：虹膜与角膜相邻，易受物理性外伤和化学性刺激作用，刺激作用包括血清蛋白、纤维素和白细胞从血管漏出，随后可发生的成纤维细胞的转化。虹膜由交感神经和副交感神经支配，因此，有拟交感神经或抗副交感神经作用的化学物质使瞳孔扩大，而有拟副交感神经和抗交感神经的化学物质能使瞳孔缩小，另外，如吗啡和全身麻醉剂等化学物质能通过中枢神经系统而改变瞳孔大小。房水是由睫状体上皮分泌，进入后房，经过瞳孔流入前房，而颈前房角的施累姆氏管流出。虹膜炎能妨碍施累姆氏管中的房水通畅而增高眼内压，由此引起青光眼。阿托品和其他散瞳药由于阻断引流而加重青光眼。睫状体内的睫状肌的收缩可使睫状带松弛，然后使晶体囊变的更成球形，该肌肉由副交感神经支配，因此，胆碱脂酶抑制剂和抗副交感神经药如阿托品能使晶体固定在不同的调节状况。眼睛毒理3.晶体已知许多化学物质可以改变晶体的透明度而导致白内障，如2,4-二硝基酚、皮质类固醇、白消安、曲帕拉醇、和铊等，这些化学物质可以在动物也可在人类出现致白内障的作用，如在家兔、大鼠和幼禽中；某些化学物质（如肾上腺皮质酮、抗胆碱脂酶药物）局部感染也可致白内障；另外，糖尿病人更容易患白内障，用四氧嘧啶或链脲菌素所致患糖尿病的大鼠和家兔也可发生白内障；喂饲大量半乳糖的大鼠也可发生白内障，该现象与半乳糖血症患儿中所见的白内障相同；还有某些营养素缺乏可引起白内障如色氨酸、蛋白质、维生素E、核黄素以及叶酸等。眼睛毒理

引起白内障的机理还未完全清楚，可能与化学物质的毒性不同而不同，如类固醇性白内障可通过抑制晶体的蛋白质合成而产生的白消安二甲磺酸丁可通过干扰晶体上皮细胞的有丝分裂而起作用的；三苯乙醇可干扰钠泵，而导致晶体钠离子和水的增加。另外，某些化学物质可引起短暂的晶体混浊，如在幼年猪、兔、狗中，某些镇静药、利尿剂和二异苯酚染毒后，可出现短暂性的晶体混浊，此外，二甲亚砜和对氯苯基丙氨酸可引起晶体屈光度的改变。眼睛毒理4.视网膜某些多环化合物如氯喹、羟基氯喹和硫利达嗪能引起人和动物视网膜病，可影响视敏度、暗适应及视网膜色素图式，氧过多和碘酸盐也可引起视网膜变化。引起视网膜病变的机理：色素上皮的蛋白质代谢抑制被认为是氯喹和羟基氯喹的原发性毒性，这些物质对黑素有强烈的亲和力；视网膜的氧供给增多，可由营养物质供给减少所致，后一种作用可能是过氧化所致的视网膜变化的原因。碘酸盐明显的影响色素上皮，它的紊乱可导致杆状细胞层蜕变。眼睛毒理5.视神经某些毒物主要侵犯中央视觉，最突出的例子是甲醇，其他物质有二硫化碳、双硫仑、乙丁氨丁醇和铊；另一方面，氯喹、五价砷和一氧化碳可致视野缩小，是由于损害了与周边视觉有关的结构。硝基苯既可侵犯中英视觉，又可侵犯周边视觉。引起视神经病变的机理还不十分清楚，可能通过抑制DNA，后者又抑制RNA转录和蛋白质合成而发生作用，五价砷似乎作用于神经节细胞的神经元。眼睛毒理眼毒理研究方法

a.肉眼检查：眼刺激试验被广发用来评价化学物质的眼刺激性。

b.仪器检查：用检眼镜检查各部位的病变情况，观察有无水肿、充血或苍白、视神经乳头萎缩、血管着色情况以及玻璃体、晶体、房水、虹膜和角膜有无变化；用视野计检测视野的变化；另外，用眼电描计法和视觉诱发反应检查视敏度和色觉力。

c.组织学和生化检查：镜检通常可明确毒物的作用部位，电镜检查可查明超微结构的变化，而生化研究能揭示毒性作用机理。药物对耳的毒性作用

耳部毒性反应主要可分为耳蜗反应和前庭反应两种。耳蜗反应影响听觉，主要表现为耳鸣、耳聋；前庭反应影响前庭器官的平衡功能，主要表现为眩晕、站立和行走不稳等症状。毒性反应的发生首先取决于所用药物的毒性和剂量，同时还与个人的体质及代谢、排泄等功能有关。药物对耳的毒性作用常见的耳毒性药物及作用特点1.奎宁和氯喹病人口服奎宁后，有时在短时间内就可有自觉的听觉症状出现，并能用音叉检查出来。有人认为它主要作用于螺旋神经节细胞所致。奎宁也可以通过胎盘使胎儿耳聋，对孕妇用药应加以小心。氯喹化学结构极似奎宁，在妊娠早期，氯喹可在服药后由血液通过胎盘，代入胎儿体内，妨碍听泡发育，造成畸形，成为神经性耳聋。成年人服中等计量氯喹后也可发生耳毒症。Maty等在豚鼠实验中证实氯喹可破坏耳蜗的末梢器官。故氯喹引起的损伤主要在柯替氏器。药物对耳的毒性作用2.水杨酸盐水杨酸盐类衍生物中，以水杨酸盐的耳毒性反应比较突出。在治疗关节炎、风湿热等疾病时，用大剂量的阿司匹林，可以引起耳鸣、听力下降等眩晕症状。水杨酸盐引起耳毒性反应的特点是听力可以完全恢复。听力损失和血浆内水杨酸盐的含量有关。Myers用猴做实验，发现在停药后，血浆水杨酸盐的浓度下降，听力也即恢复。并用光学或电子显微镜检查，未发现耳蜗内有形态学的改变，故认为这是耳蜗内生化或酶的活力改变所致。药物对耳的毒性作用3.氨基糖苷类抗生素。真正引起医务人员对药物耳毒性的重视，是在链霉素治疗结核病之后。引起耳毒性作用的氨基糖苷类抗生素包括以下4类：第一类有链霉素和双氢链霉素；第二类有卡那霉素、阿米卡星和妥布霉素；第三类包括庆大霉素、西索米星以及尼蒂霉素；第四类包括新霉素、巴龙梅素、利维霉素及核糖霉素。许多患者由于应用了各种氨基糖苷类抗生素，而出现听力下降和平衡功能紊乱。各种氨基糖苷类抗生素的耳毒性不同，而且已在各种试验动物中多次复制，特别是豚鼠最常用于耳毒性作用的