检本荧光免疫技术

荧光免疫技术教学目的要求：掌握免疫荧光显微镜技术掌握时间分辨荧光免疫技术了解荧光免疫测定的临床应用1、概述

荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法，是免疫标记技术中发展最早的一种检测方法。

近年来，随着科学技术的发展，一系列新的仪器和技术问世，使荧光技术不断完善，已从原来仅限于检测固定标本，如检测组织切片或细胞表面的抗原，扩大到进行活细胞分类检测及多种成分定量检测。荧光技术已被广泛应用于临床检测和科学研究。2、技术分类：⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术)

抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。⑵免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法第一节荧光免疫技术的特点荧光物质在吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为荧光（fluorescence）。一、荧光的基本知识（一）发射光谱指固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。（二）激发光谱指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。（三）荧光的效率：荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率荧光效率﹦发射荧光的光量子数（荧光强度）吸收光的光量子数（激发光强度）（四）荧光寿命荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。（五）荧光的淬灭

荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退成为荧光淬灭。例如紫外线照射、高温、苯胺、硝基苯、酚、I-等。（六）荧光偏振二、荧光物质第二节荧光抗体的制备一、抗体要求二、荧光素要求三、荧光素标记抗体的方法四、荧光素标记抗体的纯化五、荧光抗体的鉴定六、荧光抗体的保存第三节免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术的基本原理是：荧光抗体可与标本切片中组织或细胞表面的抗原结合，洗涤除去未结合的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光，即可对标本中的抗原物质进行鉴定。一、标本的制作荧光显微技术主要是靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果来对抗原进行鉴定和定位。因此，标本制作的好坏直接影响到检测结果。常见的临床标本有：组织、细胞和细菌三大类，可分别制成切片、印片和涂片。组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织

涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液培养细胞：单层培养细胞（人喉癌上皮细胞HEP-2)标本的固定和保存：固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等保存：4℃、-20℃二、荧光抗体染色与结果判断于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体置25-37℃

30min或4℃过夜用PBS充分洗涤镜检。试验类型

1直接法

2间接法

3双标记法两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色。返回荧光抗体染色结果判断

设立实验对照:阳性对照和阴性对照

区分特异和非特异染色

阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型

抗核抗体(均质型)抗核抗体(斑点型)抗核抗体(核膜型)

“-”：无或仅见极微弱荧光。

“+”：荧光较弱但清楚可见。“++”：荧光明亮。“+++”：耀眼强荧光。特异荧光强度“+”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。根据呈"+"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。

三、荧光显微镜检查

利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

经荧光抗体染色的标本，需要在荧光微镜下观察。一般要求染色后立刻镜检，以防荧光消褪，造成假阴性结果。

荧光显微镜的基本结构光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：消色差镜头隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长的光域，提供合适的激发光。

吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。返回透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路(b)透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。基本原理：将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。第四节荧光免疫分析荧光免疫测定的方法类型非均相荧光免疫测定：

时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定均相荧光免疫测定：

荧光偏振免疫测定时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)基本原理：是用镧系稀土元素螯合物（如Eu3+）标记抗体或抗原，检测标本中的抗原或抗体。此螯合物具有较长荧光寿命，得用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，可排除标本中非特异性荧光的干扰，所得信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧光。时间分辨检测原理示意图自发荧光寿命短:1ns～10ns镧系元素寿命长:10μs～1000μs短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图方法评价和临床应用灵敏度高：最小检出量10-18mol/L标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化易受污染，本底增高因此,是很有发展前途的超微量物质免疫分析技术。第五节荧光免疫技术的应用

荧光抗体技术在临床上可用作肿瘤细胞的诊断；细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的协助诊断等方面。一、荧光显微镜技术的应用二、荧光免疫测定的应用思考题1．荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光淬灭的概念是什么？2．常用的荧光物质有哪些？3．荧光免疫技术有哪些类型？4．荧光抗体技术的基本原理是什么？3．什么是荧光抗体？如何制备、纯化和鉴定荧光抗体？4．荧光抗体染色有哪些方法？各自的反应原理是什么？5．荧光免疫测定的基本原理是什么？有哪些方法类型?课堂练习1、用于标记荧光抗体的荧光素应符合下列要求，除外A与蛋白质分子形成离子键B荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率C荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明D与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化和免疫学性质E标记方法简单，安全无毒（A）2、荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是A光源B滤板C聚光器D目镜E物镜（D）3、不能作为荧光显微镜光源的是A高压汞灯B氚灯C紫外灯D氙灯E卤素灯（C）4、荧光抗体染色技术中，特异性最高，非特异性染色最低的方法是A直接法B间接法C补体结合法D双标记法E以上都不对(A)5、目前公认的最有效的检测抗核抗体的方法是AELISAB放射免疫技术C直接凝集实验D直接荧光法E间接荧光法(E)6、FITC在紫外光的激发下，所产生的荧光为A灰蓝色B黄绿色C橙色D暗红色E橙红色（B）7、双标记荧光抗体技术的主要用途是A提高荧光强度B提高荧光效率C可同时检测同一标本中两种抗原D使用一种标记物可检测多种抗原E减少非特异性荧光（C）8、时间分辨荧光免疫测定特点中不包括A标记物荧光衰变时间长B测定范围狭窄C标记物为镧系元素D能排除非特异性荧光的干扰E荧光强，灵敏度高（B）9、下列有关时间分辨荧光免疫测定的叙述中，错误的是