核酸与核苷类药物

第一节概述一、基本概念核酸与核苷类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷或者碱基天然的、类似物、衍生物及其聚合物作用：影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢恢复正常代谢或干扰某些异常代谢用途：放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩、肿瘤、病毒病第1页/共28页核酸是一种多聚体大分子，它的组成单元是核苷酸，将核苷酸中的磷酸基团去掉，剩余部分称核苷，核苷进一步分解可生成戊糖和碱基。胰核酸酶胰、肠核苷酸酶核苷酶第2页/共28页嘌呤核苷酸GMPAMP嘧啶核苷酸的结构第3页/共28页核酸类药物分类

——具有天然结构的核酸类物质如：ATP、GTP、CTP、UTP、IMP、CoA、CoI(NAD+)

、CoII(NADP+)

。这类药物有助于改善物质代谢和能量平衡，修复受损组织，促使缺氧组织恢复正常生理机能。临床上广泛用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩等的治疗。这些药物多数是生物体自身能够合成的物质，在具有一定临床功能的前提下，毒副作用小，它们的生产基本上都可以经微生物发酵或从生物资源中提取。ATP：用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭、及动脉或冠状动脉硬化、肝炎等的治疗或辅助治疗。肌苷(IMP)：用于急慢性肝炎、肝硬化、白细胞减少、血小板减少等。第4页/共28页核酸类药物分类

——自然结构核酸类物质的类似物和聚合物它们是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要药物，也是产生干扰素、免疫抑制剂的临床药物。主要有叠氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、聚肌胞等。第5页/共28页他莫昔芬扰雌激素的某些活动,模拟其它雌激素作用.用于治疗某些乳腺癌和卵巢癌.第6页/共28页（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸

1、酶解法制备脱氧核苷酸桔青霉产生5`-磷酸二脂酶

红酵母产生3`-磷酸二脂酶二、核苷酸的生产方法第7页/共28页

第8页/共28页2、酶解法制备戊糖核苷酸

我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸）3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。酶解法生产5‘-单核苷酸工艺流程第9页/共28页3．菌体自溶法生产核苷酸磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5’-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5’-核苷酸。菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：第10页/共28页4．碱水解法生产2’,3’-混合核苷酸RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定,很容易生成2,3-环状磷酸酯,此环状磷酸酯对碱更不稳定,很易加水分解生成2,3-混合核苷酸。取RNA配成3％～3.5%的水溶液,加氢氧化钠达0.3mol/L浓度,升温至38℃,保温16～20小时,用6mol/L盐酸中和至pH7.0,从RNA水解成2,3-核苷酸的降解率达95％以上,将2,3-混合核苷酸制成每片含50～100mg的片剂,经临床使用,对非特异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。第11页/共28页（二）发酵法生产核苷酸1．发酵法生产肌苷酸（IMP）2、发酵生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷酸第12页/共28页IMP生成总反应过程第13页/共28页①SAMP合成酶③IMP脱氢酶②SAMP裂解酶④GMP合成酶AMP和GMP的生成SAMP黄苷酸肌苷酸肌苷酸肌苷酸第14页/共28页（三）半合成法制备核苷酸(略)由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成5’-核苷酸收率可达90%。例一：肌苷2mmol/L悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol/L，水2mmol/L，反应2h，5’-IMP摩尔产率达91％。例二：鸟苷2mmol/L悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol/L，水2mmo/L，反应6h，5’-GMP摩尔产率达90%。第15页/共28页第二节核酸类物质的生产

一、RNA的提取与制备1.RNA的工业来源从微生物中提取RNA，是工业上最实际和有效的方法，一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源。通常在细菌中RNA占5％-25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%~28%,面包酵母含RNA4.1％～7.2％。

2.高RNA含量酵母菌体的筛选酵母菌体收率高，易于提取RNA。可以从自然界筛选并可用诱变育种的方法提高酵母的RNA含量。第16页/共28页发酵法生产高含量RNA酵母及其RNA提取工艺流程见图第17页/共28页2.RNA提取实例第18页/共28页二、DNA的提取与制备

DNA，可以促进细胞的活化，调节新陈代谢，延缓机体衰老，维护正常免疫功能有积极的作用。1．工业用DNA的提取从冷冻鱼精中提取。鱼精中主要含有核蛋白、酶类以及多种微量元素。核蛋白的主要成分是脱氧核糖核酸(DNA)和碱性蛋白质(鱼精蛋白)，其中DNA占大约2／3。第19页/共28页2．具有生物活性DNA的制备可从动物内脏（肝、脾、胸腺）中提取制备，操作条件0～3℃。动物内脏加4倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗涤后离心，将沉淀悬浮于20倍量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5％十二烷基磺酸钠，并搅拌2～3小时，在0℃2500rpm离心，在上层液中加入等体积的冷乙醇，离心即可得纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。第20页/共28页三、核苷类药物的制备

发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果，产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种核苷的菌株有着许多共同特点：①它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽抱杆菌为诱变出发菌株；②它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在遗传性状上具有特定标记的诱变菌；③它们在发酵培养时必须提供限量的生长因素，并且好氧，在某一特定的范围内累积大量核苷。第21页/共28页ADPAMPGMPGTPGDPSAMPIMPXMPAMP脱氨酶IMP脱氢酶GMP还原酶SAMP合成酶PRPPAICARSAICARPRPPATPSAMP裂解酶GMP合成酶

在右边的合成途径中，嘌呤核苷酸生物合成的第一个酶PRPP转酰胺酶受AMP、ADP、以及腺嘌呤衍生物的强烈抑制而受鸟嘌呤衍生物的抑制很弱。IMP脱氢酶受最终产物GMP及鸟嘌呤衍生物反馈抑制，SAMP合成酶受AMP反馈抑制的。枯草杆菌的腺嘌呤缺陷型，当培养基中提供限量腺嘌呤时就累积肌苷。而枯草杆菌的腺嘌呤、黄嘌呤缺陷型，当培养基中提供限量鸟嘌呤时就累积腺苷。枯草杆菌的嘌呤核苷酸合成途径PRPP转酰胺酶强弱第22页/共28页生产菌株：（1）酶6、7缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累IMP---肌苷（肝炎辅助药）；（2）酶4缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累XMP---黄苷；（3）酶5缺失积累鸟苷。第23页/共28页肌苷生产菌（AJ11102）遗传性状：（菌种见P197）①腺嘌呤缺陷型（A-）；②GMP还原酶缺失（GMPred-）；③磺胺脒抗性（SGr）；④精氨酸缺陷型（Arg-）。选育出从遗传上解除正常代谢控制的理想菌株。肌苷产率达20g/L.（一）发酵法生产肌苷（I或Iou）第24页/共28页碳源为葡萄糖；保证充足的氮源（肌苷高的含N）；Mg+、Ca+有促进作用；最适发酵温度为30--34℃，pH6.0—6.2；需大风量,高溶氧和低CO2第25页/共28页（二）聚肌胞苷酸（聚肌胞）(略)1、结构与性质1967年美国人Field发现聚肌胞是干扰素诱导物，而且具有广谱抗病毒作用。本品是人工合成的干扰素诱导剂，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸。本品可溶于0.85％氯化钠溶液。2、生产工艺70年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下：1）底物5’-核苷二磷酸吡啶盐的制备（P199）第26页/共28页（3）固定化多核苷酸磷酸化酶，将分离纯化的酶液滴加入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化。3）PolyI：C制备（1）底物预处理：CDP吡啶盐转成锂盐，IDP转成钠盐。（2）酶促反应：（每毫升反应液含μmol／L数）IDP或

CDP15；Tris150；MgC126；

2）固定化多核苷酸磷酸化酶的制备第27页/共28页EDTA1；聚合酶5