X3-1-4 蛋白质工程的崛起

11.4蛋白质工程的崛起专题1基因工程2一、蛋白质工程崛起的缘由

通过基因工程能够大规模生产生物体内微量存在的活性物质，并借助转基因而改变动植物性状，得以在人类医疗保健中进行基因诊断和基因治疗。然而在广泛利用自然界各种蛋白质的过程中就发现，这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对它们进行产业化开发往往不合意，需要加以改造。1983年Ulmer首先提出蛋白质工程，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此以后，蛋白质工程迅速发展，已成为生物工程的重要组成部分。3

在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。4

例如：干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为106U/mg，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的β-干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发现，β-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的β-干扰素的抗病性活性提高到108U/mg，并且比天然β-干扰素的贮存稳定性高很多。改造干扰素（半胱氨酸）体外很难保存干扰素（丝氨酸）体外-70℃可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）天冬氨酸激酶（异亮氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）玉米中赖氨酸含量可提高数倍改造改造5倍2倍61、基因工程的应用（1）基因工程的实质：将一种生物的

转移到另一种生物体内，使后者产生本不能产生的

，进而表现出新的

。（2）基因工程的不足：在原则上只能生产自然界已存在的

。2、天然蛋白质的不足天然蛋白质是生物在长期

过程中形成的，它们的

符合特定物种

的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。3、蛋白质工程的目的生产符合人类生产和生活的需要的

。基因蛋白质性状蛋白质进化结构和功能生存蛋白质7“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。8二、蛋白质工程的基本原理基因DNAmRNA氨基酸序列多肽链蛋白质三维结构转录翻译生物功能预期功能折叠分子设计DNA合成蛋白质工程中心法则流程图9例1.科学家将β－干扰素基因进行定点突变导入大肠杆菌表达，使干扰素第17位的半胱氨酸改变成丝氨酸，结果大大提高了β－干扰素的抗病活性，并且提高了储存稳定性。该生物技术为A.基因工程B.蛋白质工程C.基因突变D.细胞工程B10蛋白质工程的概念基础:实质：途径:目标:蛋白质的结构和功能基因修饰或基因合成

改造或制造新的蛋白质，满足人类的生产或生活的需要是对编码蛋白质的基因进行改造11例2.以下关于蛋白质工程的说法正确的是（）A、蛋白质工程以基因工程为基础B、蛋白质工程就是酶工程的延伸C、蛋白质工程就是用蛋白酶对蛋白质进行改造D、蛋白质工程只能生产天然的蛋白质A12蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了

解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。13异亮氨酸半胱氨酸14基因定点诱变技术的示意图15基因定点诱变技术的理解(苏教版)项目内容条件原料酶引物能量

ＡＴＰ操作方法

ＰＣＲ法结果适应范围后代中半数为诱变的ＤＮＡ分子脱氧核苷酸ＤＮＡ聚合酶和ＤＮＡ连接酶含突变顺序的ＤＮＡ分子片段空间结构完全清楚的蛋白质16思考：基因定点诱变技术与基因突变的比较比较基因定点诱变基因突变相同点发生的过程结果不同点场所手段方向DNA复制过程中产生新基因，从而产生新性状生物体外生物体内定向改造不定向性PCR技术物理化学方法171、目标：根据人们对

功能的特定需求，对蛋白质的

进行分子设计。2、原理：改造基因（基因

或基因

）。3、途径：预期蛋白质功能→设计

→推测应有的

序列→找到对应的

序列。蛋白质结构修饰合成预期的蛋白质氨基酸脱氧核苷酸

对天然蛋白质进行改造，你认为直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？18（一）蛋白质的分子设计与改造蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质的一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累了成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，并编制成系统的数据库，得以从中找出蛋白质分子间的进化关系、一级结构和高级结构的关系、结构与功能的关系方面的规律。19

蛋白质作为生物大分子是生物化学和分子生物学的研究重点，大量蛋白质被分离纯化，测定了它们的结构、性质和生物学作用。分子生物学有关基因组的研究，也可以用以推测出一些未知蛋白质的结构与功能。采用定位诱变的方法，可以对编码蛋白质的基因进行核苷酸密码子的插入、删除、置换和改组，其结果为分子改造提供新的设计方案。现有的蛋白质是生物长期进化的结果，蛋白质工程则是对生物进化的模拟，按照蛋白质形成的规律，改造蛋白质或构建新的蛋白质。20

蛋白质的改造通常需要先经周密的分子设计，然后依赖基因工程获得突变型蛋白质，以检验其是否达到了预期的效果。如果改造的结果不理想，还需要重新设计再进行改造，往往经历多次实践摸索才能达到改进蛋白质性能的预定目标。21（二）蛋白质改造工程举例1．水蛭素改造水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由65或66个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体HV2的设计方案，将47位的Asn（天冬酰胺）变成Lys（赖氨酸），使其与分子内第4或第5位Thr（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素N端肽段的正确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高4倍，在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高20倍。222．生长激素改造生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸侧链，如第18和第21位His（组氨酸）和第17位Glu（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作为临床用药还有大量的工作要做。233．胰岛素改造天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素β23-β28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，如β28位改为赖氨酸、β29位改为脯氨酸，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。244．治癌酶的改造癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它结构类似物磷酸化而使这些碱基3’-OH缺乏,从而阻断DNA的合成，杀死癌细胞。HSV—TK催化能力可以通过基因突变来提高。从大量的随机突变中进行筛选出一种酶,在酶活性部位附近有6个氨基酸被替换，催化能力20倍以上。25

蛋白质工程的发展很快，研究工作很多，以上仅介绍了几个例子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质外，其本身还是研究蛋白质结构功能的一种强有力的工具，它在解决生物理论方面所起的作用，可以和任何重大的生物研究方法相提并论。26例3.干扰素是动物体内的一种蛋白质，可以用来治疗病毒的感染和癌症，但在体外保存相当困难，如何长期保存，科学家发现干扰素中的一个半胱氨酸变成丝氨酸，可以保存半年。你来设想一下，能不能让动物生产能够长期储存的干扰素？采用什么方法？

能生产长期储存的干扰素。用氨基酸序列反推信使RNA序列，再反推DNA序列，然后进行基因改造。27何谓蛋白质工程？

在现代生物技术中，蛋白质工程出现得最晚，是在20世纪80年代初期出现的。1983年“蛋白质工程”这个名词出现后，随即被广泛接受和采用。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。28

对照密码表，至少写出三种决定“—丙氨酸—色氨酸—赖氨酸—甲硫氨酸—苯丙氨酸—”的脱氧核苷酸序列。讨论（1）mRNA序列为：

GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C）脱氧核苷酸序列：

CGA（或G或T或C）ACCTTT（或C）TACAAA（或G）（2）确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。29起始密码30比较项目基因工程蛋白质工程程序上合成的是否是自然蛋白质顺着中心法则逆着中心法则是不是蛋白质工程和基因工程的区别31项目蛋白质工程基因工程区别原理中心法则的逆推基因重组过程预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→推测脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质获取目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)结果生产自然界没有的蛋白质生产自然界中已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现重组创新321.进展胰岛素速效型药品2.前景制作电子元件3.现状蛋白质工程目前成功的例子不多,原因是对蛋白质的高级结构了解不够。要设计出更加符合人类需求的蛋白质还需经过艰辛的探索。应用于微电子方面具耗电少和

的特点体积小效率高三、蛋白质工程的进展和前景如β28位改为赖氨酸、β29位改为脯氨酸，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。33例4.某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶的结构和功能很相似，只有对热稳定性较差，进入人体后容易失效。现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗食物的消化不良，最佳方案是A.对此酶中的少数氨基酸替换，以改善其功能B.将此酶与人蛋白酶进行拼接，形成新的蛋白酶C.重新设计与创造一种全新的蛋白酶D.减少此酶在片剂中的含量A341、下列关于蛋白质工程的说法错误的是A．蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类的需要B．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构C．蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子D．蛋白质工程与基因工程密不可分，又被称为第二代基因工程B练习353、下列各项中不属于蛋白质工程在医学上应用的是（）A.基因芯片用于HIV诊断B.t-PA用于医治心肌梗死C.速效胰岛素用于治疗糖尿病D.人—鼠嵌合抗体用于识别、杀伤肿瘤细胞2、蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是A．氨基酸结构B．蛋白质空间结构C．肽链结构D．基因结构DA364、蛋白质工程的基本流程正确的是①蛋白质分子结构设计②DNA合成③预期蛋白质功能④根据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列A．①②③④B．④②①③C．③①④②D．③④①②C375、蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来的第二代基因工程，其结果产生的蛋白质是A．氨基酸种类增多B．氨基酸种类减少C．仍为天然存在蛋白质D．可合成天然不存在蛋白质D386、枯草杆菌产生的蛋白酶具有催化分解蛋白质的特性，但极易被氧化而失效。1985年，美国的埃斯特尔将枯草杆菌蛋白酶分子中的第222位氨基酸替换后，虽然其水解活性有所下降，但抗氧化能力大大提高。用这种水解酶作为洗涤剂的添加剂，可以有效地除去血渍、奶渍等蛋白质污渍。（1）改造枯草杆菌蛋白酶的生物技术是

。（2）改造后的枯草杆菌中的控制合成蛋白酶的基因与原来相比，至少有

个碱基对发生变化。（3）利用生物技术改造蛋白质，是提高了蛋白质的

性，埃斯特尔所作的工作是对已知蛋白质进行

。蛋白质工程1稳定少数氨基酸的替换39思考与探究（P28）1.解析：蛋白质工程的崛起主要是工业生产和基础理论研究的需要。而结构生物学对大量蛋白质分子的精确立体结构及其复杂的生物功能的分析结果，为设计改造天然蛋白质提供了蓝图。分子遗传学的以定点突变为中心的基因操作技术为蛋白质工程提供了手段。在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大