高二生物植物的组织培养

第5章植物的组织培养实验目的：1.掌握植物组织培养基(MS)的配制(MurashigeandSkoog)

2.通过实验，掌握无菌操作方法，熟悉烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立的整个过程。3.学习再生体系的建立方法，为掌握其他植物的组织培养奠定基础；同时为转基因技术提供一个平台。植物组织培养基的配制烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立实验用品：1.仪器和用品：500ml试剂瓶1个；100ml试剂瓶5个；250ml试剂瓶4个；高压灭菌锅；电子天平；烧杯（大、中、小各2个）、玻璃棒、移液管、搪瓷缸、培养瓶、电炉、pH计或精密pH试纸、容量瓶（大、中、小各1个）2.化学药品及试剂汉语名分子式生产公司分子量纯度硝酸铵NH4NO3上海通亚精细化工厂80.04分析纯磷酸二氢钾KH2PO4中国江苏南京中山集团公司化工厂136.09硝酸钾KNO3上海鑫达精细化工有限公司101.10硫酸镁MgSO4.7H2O山东省化工研究院246.47氯化钙CaCl2.2H2O(上海)四联化工厂147.03

硫酸锰MnSO4.4H2O上海试剂工厂169.02硫酸锌ZnSO4.7H2O山东潍坊市试剂厂287.54硼酸H3BO3济南化学试剂厂61.83碘化钾KI上海化学采购站166.064钼酸钠Na2MoO4.2H2O北京五十六0一化工厂241.95分析纯氯化钙CaCl2.6H2O济南试剂总厂237.93五水硫酸铜CuSO4.5H2O济南化学试剂厂249.68

汉语名分子式生产公司分子量纯度乙二胺四乙酸钠Na2-EDTA.2H2O济南试剂总厂372.24分析纯硫酸亚铁FeSO4.7H2O山东博山化学试剂厂278.01分析纯

甘氨酸C2H5NO2中国科学院上海生物化学研究所75.07分析纯盐酸吡哆醇C8H11O3N.HCl中国医药上海化学试剂站205.64盐酸硫胺素C12H17ClH4OS.HCl中国新兴化工试剂研究所337.27烟酸C6H5NO2北京芳草医药化工研制公司123.11化学纯肌醇C6H12O6中国政翔化学试剂研究所180.16

3-吲哚乙酸IAA（b-Indoleaceticacid）天津天泰精细化工品有限公司125.1分析纯萘乙酸NAAC12H10O2中国医药上海化学试剂公司186.21化学纯叶酸C19H19O6N7上海化学试剂厂441.422,4-D（2,4-dichlorophenoxyaceticacid）上海雪满生物科技有限公司6-BA（N6-benzylaminopurine）上海伯奥生物科技有限公司225.25蔗糖sucrose天津市广成化学试剂有限公司342.29分析纯琼脂Agar国药集团化学试剂有限公司B.RMS培养基配制表母液化合物含量（终浓度）mg/L母液称量（mg）配制量（ml）吸取量（ml/L）1号NH4NO3KNO3KH2PO4MgSO4.7H2O16501900170370165001900017003700500（扩大20倍）502号CaCl24404400同上503号ZnSO4.7H2OMnSO4.4H2OH3BO3NaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2OKI8.622.36.20.250.0250.0250.83430111531012.51.251.2541.5500（扩大100倍）104号Na2－EDTAFeSO4.7H2O37.327.8746556100（扩大200倍）55号VB1VB6甘氨酸烟酸（VB3）0.40.520.5202510025500（扩大100倍）106号肌醇1001000100107蔗糖3％30g8琼脂0.6％－1.2％8g

MS母液配制用量g.L-1每升培养基取用量mL/L大量元素(20倍)KNO338

NH4NO33350MgSO4·7H2O7.4KH2PO43.4CaCl·2H2O8.8微量元素(200倍)MnSO4·4H2O4.465ZnSO4·7H2O1.72H3BO31.24KI0.166NaMoO4·2H2O0.05CuSO4·5H2O0.005CoCl·6H2O0.005铁盐Na2-EDTA·2H2O7.465FeSO4·7H2O5.56有机附加物(200倍)甘氨酸(氨基乙酸)0.25VB60.05VB10.01烟酸0.05肌醇0.01生长素类在组培中的作用：诱导细胞的分裂和根的分化。常用种类及作用：IAA(吲哚乙酸)、NAA、IBA、NOA（萘氧乙酸）、2.4－D、2.4.5－T（三氯苯氧乙酸）使用时先配成母液，母液的浓度一般为0.1mg/ml或1mg/ml；配时一般先将其粉末溶于95％乙醇或0.1mol/L的NaOH中，再定容。细胞分裂素类在组培中的作用：促进细胞分裂和由callus或器官上分化不定芽。常用种类及作用：BAP（苄氨基嘌呤）、6－BA（苄基腺嘌呤），zip（异戊烯氨基嘌呤）和KN（激动素）使用时先配成母液，母液的浓度一般为0.1mg/ml或1mg/ml；配时一般溶于0.5或1mol/L的HCl或稀薄的NaOH中，再定容。实验步骤：1.母液的配制：见MS培养基配制表2.培养基的配制：1）称取一定量的蔗糖，溶解于适量蒸馏水中（不能太多），倒入500ml容量瓶中。2）吸取各种母液（吸取量根据培养基的最终体积决定），加入到上述容量瓶中。3）吸取各种激素（所配制的培养基是：MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L），加入到上述容量瓶中。4)定容到500ml。5）将上述溶液调pH值到5.8-6.0。6)将上述溶液加入琼脂后，于电炉上煮沸。7）将上述培养基冷却至40-50摄氏度后，将其分装到100ml三角瓶中。8）将三角瓶用封口膜封口。并对不同的培养基做好标记。3.灭菌：通常培养基应在汽相121摄氏度的条件下在高压灭菌锅内灭菌20min。在高压灭菌锅的加热过程中，在气压指针上升到0.05Mpa时，放一次气，然后在温度达121摄氏度时，保持此压力灭菌15-20min。灭菌完成后，待灭菌锅的压力降到0时，打开灭菌锅，取出培养基，放平，待培养基凝固后备用。注意事项：1.实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。2.用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀性的药品，应将其放在小烧杯中称量。3.各种母液应保存在2-4摄氏度的冰箱中，以免变质、长霉。4.用高压灭菌锅时，一定要先检查一下其中的水是否合适。接种：在无菌的条件下，取烟草无菌苗的叶片，剪成（0.5～1cm）*(0.5～1cm)大小的小块，接种于诱导培养基MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L中诱导愈伤组织，在此培养基上能诱导出愈伤组织并能够诱导出不定芽。不定芽生根：将在愈伤组织中生成的不定芽移栽到1/2MS培养基中，其目的是诱导不定芽生根，使其发育成烟草小植株。植物材料灭菌的常用药品和原理1.乙醇：原理：脱水作用和溶脂性，从而使Protein脱水、变性、沉淀及质膜破损、透性增加，使微生物致死。使用浓度：70％（V/V）灭菌时间：5－60s2.次氯酸盐：原理：在水中形成次亚氯酸（HClO），HClO分解后形成盐酸和新生态氧（HClO→HCl+〔O-〕），〔O-〕具有很强的氧化性而具有杀菌作用。使用浓度：0.5％－2.5％的有效氯灭菌时间：5－15min3.升汞（HgCl2）：原理：汞离子可与带负电荷的蛋白质结合，使菌体蛋白变性，酶失活。其杀菌效力极强。使用浓度：0.1-0.2％（W/V）灭菌时间：10min4.新洁尔灭：原理：广谱表面活性灭菌剂。使用浓度：1：200（V/V）灭菌时间：30min或更长

接种第一天

接种第二