人工诱发单倍体及其应用

第十三章人工诱发单倍体及其应用第一节植物单倍体概念及人工诱发单倍体的应用二倍体(diploid)植物其单倍体（haploid）即一倍体（monoploid）如，玉米2n=2x=20n=x=10；水稻2n=2x=24n=x=12四倍体(tetraploid)植物其haploid为dihaploid如，马铃薯2n=4x=48，n=2x=24六倍体(hexaploid)植物其haploid为triploid如，普通小麦2n=6x=42，n=3x=21八倍体(octoploid)植物其haploid为tetraploid如，草莓2n=8x=56，n=4x=28单倍体(haploid)——指具有配子体（gametophyte）染色体数的孢子体(植物个体)(sporophyte)。

一、植物单倍体与人工诱发单倍体的应用人工诱发单倍体（artificialinducedhaploid）——单倍体细胞在人工离体条件下培养，使其单性发育成植物体。人工诱发单倍体的方法：组织和细胞离体培养远缘杂交体细胞染色体消失异质体孪生苗半配合和辐射等一、植物单倍体与人工诱发单倍体的应用单倍体的优点：1.单倍体的每个染色体组都是单的，加倍后，由不育变可育，快速纯合；2.单倍体每一种基因都只有一个，在单倍体内，每个基因都能发挥自己对性状发育的作用，不再区分基因的显隐性，是研究基因性质及作用的优良材料；3.异源多倍体的各个染色体组之间并不是绝对异源的，一些染色体组间的染色体可能存在部分同源的关系，对研究物种起源和进化有帮助。二、植物单倍体在植物遗传育种中的应用应用：1.利用单倍体植物控制杂种分离，加快常规育种速度；2.排除显隐性基因的干扰，提高育种的选择效率；3.遗传分析；4.物种进化研究。二、植物单倍体在植物遗传育种中的应用第二节花药培养一、概述概念花药培养:把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上,使其发育和分化成为植株的过程.花药培养和花粉培养是获是植物单倍体的有效方法之一

体细胞染色体数减半；单倍体植物与二倍体相比较，有三个明显的特点：

生长发育弱，体形小、各器官明显减小；

雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。

（二）花药或花粉培养在作物育种中的作用：供体植株小孢子（N）花粉培养花粉植株（N）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株（2N）（1）缩短育种年限：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需1-2年。一年内获得纯系例：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株常规方法：AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。

（2）提高了目标基因型的选择效率

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb Aabbab aAbB aabB aAbb aabb例：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株单倍体方法：AAbb出现的概率为1/4。

单倍体

二倍体

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供体亲本AaBb花粉培养

（2）提高了目标基因型的选择效率

植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。利于筛选隐性突变体提高诱变效率。

（3）诱变育种中的作用

（4） 利于获得优良植株如：芦笋全雄系的培育

（5）用作基础研究的各个领域花药的结构及花粉管的形成花药的结构及花粉粒的发育2NN减数分裂

四分体4个单核花粉粒（细胞壁薄、细胞质浓、核位于细胞中央）

营养细胞（大）单核花粉粒（单核靠边期）（两者仅以质膜相隔）精细胞生殖细胞（小）有丝分裂

（2-细胞花粉粒）精细胞

(3-细胞花粉粒）N双核早期（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径1、A途径小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞（1）A-V途径由营养细胞重复分裂形成单倍体（2）A-G途径由生殖细胞重复分裂形成单倍体（3）A-VG途径（E途径）由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体（4）C途径营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株2、B途径小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株。（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径（四）花药培养与花粉培养的异同点培养目的相同，均获得小孢子植株。花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。花粉培养没有药壁组织干扰，单倍体产量高。（一）研究历史：首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari(1964,1966)。1996年的统计数据表明,已有至少250多种植物花药培养成功。

花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。二、花药培养技术（二）花药培养的基本程序是：外植体选择－消毒—剥取花药—接种—诱导培养—植株再生外植体的选择：供试材料的遗传背景，供试材料的生理状态，花粉的发育时期等。

四分体4个单核花粉粒（细胞壁薄、细胞质浓、核位于细胞中央）

营养细胞（大）单核花粉粒（单核靠边期）（两者仅以质膜相隔）精细胞生殖细胞（小）有丝分裂

（2-细胞花粉粒）精细胞

(3-细胞花粉粒）N双核早期

选择花药时，一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。（二）花药培养的基本程序是：外植体选择－消毒—剥取花药—接种—诱导培养—植株再生花药的剥取：避免花药受到损伤，因为损伤常会刺激花药壁组织的发育，形成二倍体的愈伤组织。花药预处理大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。

花药培养常用的基本培养基：

N6：高硝态氮，低铵态氮，广泛用于禾本科植物的花药培养

B5、MS、White、Nitch等。

C17（王培等，1986）：适于小麦花药培养，提高出愈率。激素：相对较低的激素水平蔗糖：一般2-3%，高浓度对禾谷类较有利

番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应蔗糖浓度2％3％4％6％10％13％

17％

诱导频率5％10％12％18％25％45％

8％培养条件－温度和光照：第三节花药培养注意的问题1.材料选择（基因型；生理状态；光照；花药发育时期）2.预处理：如低温冷藏3.材料灭菌4.花粉植株诱导花药和花粉培养中的白花苗白化苗的控制

花粉发育时期：花药培养中，白花苗的比例随接种时花粉发育时期的延迟而提高。培养基成分：高浓度的2,4-D会使花粉愈伤组织分化出更多的白化苗培养温度：当培养温度提高时，白花苗的数目也随之增加。第四节花粉培养花粉培养(小孢子培养):从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.花粉培养技术1、取材时期：四分体时期到单核早期。花粉培养技术2、花粉的分离：1）自然散落法(漂浮培养自然释放法)：将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2）机械游离法

a.磁搅拌法：用磁力搅拌器低速搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；

b.挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。花粉培养技术3、小孢子纯化：对获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子花粉培养技术4、花粉的培养平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。液体培养：花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。双层培养：先铺一层琼脂固体培养基（加入失活花药的浸提液），凝固后，在表面加入少量液体培养基培养。看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。看护培养图解

1、胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。花粉植株的形态发生方式烟草花药培养——通过胚状体途径再生形成小植株

2、愈伤组织发育途径：小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异