水处理生物学实验

水处理生物学实验实验要求上课准时、不得无故缺席，实验报告要及时上交。实验期间不得大声喧哗、服从老师的安排、注意安全。实验器材专人专用，对仪器要爱护，损坏实行赔偿制度。维护好实验室的环境卫生，实行值日生制度。实验报告要求统一用A4纸手写实验报告封面格式

1、实验课程名称

2、实验项目名称

3、学生所在的专业、班级、姓名、学号

4、实验日期

5、同组者姓名实验报告格式

1、实验目的

2、实验原理

3、实验仪器、溶液试剂

4、实验步骤

5、实验结果（如绘图、列表等）

6、思考题实

验

内

容显微镜的使用及酵母菌、曝气池中微生物等形态观察放线菌、霉菌的形态观察油镜的使用、细菌的单染色和革兰氏染色微生物大小测定、显微镜直接计数法培养基的制备及灭菌水体中细菌总数测定与大肠菌群生理生化反应实验一（一）显微镜的构造、性能和使用方法一、目的要求了解普通光学显微镜的构造、基本原理、维护和保养的方法学习并掌握普通光学显微镜的正确使用方法二、显微镜的基本结构（一）机械装置镜座镜臂镜筒：单筒和双筒两种物镜转换器载物台载物台转移器调焦装置粗调节器细调节器（二）光学系统接目镜（目镜）接物镜（物镜）低倍镜（10×）高倍镜（40×）油镜（100×）聚光镜虹彩光圈反光镜增加显微镜的分辨率显微镜的放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大倍数显微镜的分辨率：显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。

D=λ/2NA=λ/2n·sin(α/2)D：分辨率NA：物镜的数值孔径值：可见光的波长（平均0.55m)n:物镜和被检标本间介质的折射率：镜口角（即入射角）四、显微镜的使用方法观察前的准备显微镜的安置光源调节根据个人情况，调节双筒显微镜的目镜右眼看清调节左目镜的视度调节圈扳动镜管，调节至瞳孔间距显微观察低倍镜观察高倍镜观察（同焦现象）油镜观察在待观察的样品区域滴加香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中。显微镜用毕后的处理上升镜筒，取下载玻片；用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去镜头上残留的油迹，最后用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯；用擦镜纸清洁物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件；将镜体各部分复原。

五、思考题使用显微镜时哪些地方须特别？二、酵母菌、曝气池中微生物等形态观察

目的要求观察酵母菌的形态及出芽生殖方式；学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；观察曝气池中的微生物形态基本原理美蓝是一种无毒性染料.氧化型呈现蓝色,还原型呈现无色.用美蓝对酵母的活细胞进行染色,代谢活力强的细胞具有较强的还原能力,能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型.因此,具有还原能力的酵母活细胞为无色,死细胞或代谢能力弱的衰老细胞为蓝色.实验器材菌种红酵母啤酒酵母曝气池活性污泥混合液溶液或试剂

0.1%吕氏碱性美蓝染色液仪器或其他用具显微镜，盖玻片，载玻片，滤纸，擦镜纸。（一）酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别制片在载玻片中央加一滴0.1%美蓝→取菌少许→混匀→盖上盖玻片→静置3min或0.5h观察用高倍镜观察酵母的形态和出芽生殖根据颜色鉴别死活细胞活细胞：无色；死细胞：蓝色（二）曝气池中微生物的形态观察在载玻片中央加一滴活性污泥曝气池混合液→打散混匀→盖上盖玻片→低倍镜观察→高倍镜观察→绘出所观察到的微生物形态实验结果绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。分别绘出你在低倍镜、高倍镜观察到的菌胶团、原生动物、藻类等的基本形态。吕氏碱性美蓝染色液作用时间不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。思考题实验二、放线菌、霉菌的形态观察目的要求学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的基本方法；初步了解放线菌的形态特征；了解四类常见霉菌的基本形态特征。实验器材菌种细黄链霉菌，曲霉、青霉、根霉、毛霉培养基高氏Ⅰ号琼脂培养基察氏琼脂培养基溶液或试剂0.1%美蓝染色液，乳酸石碳酸棉蓝染色液,50%乙醇仪器或其他用具显微镜，盖玻片，载玻片，接种环，解剖针等。扦片法倒平板→取孢子划线接种→无菌操作将灭菌的盖玻片以大约45℃扦在接种线上→28℃倒置培养3-5d→取培养后的盖玻片直接镜检或用0.1%美蓝对盖玻片染色后观察观察基内菌丝、气生菌丝、孢子丝的卷曲状况，以及分生孢子的形状，并绘图说明。（一）放线菌的形态观察（二）霉菌的形态观察直接制片观察法在载玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液；用解剖针挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先用50％乙醇洗去脱落的孢子，再放在载玻片的染液中(青霉、曲霉取菌丝时需连同培养基一起挑取)；用解剖针小心分散菌丝，盖上盖玻片；置低倍镜或高倍镜下观察。绘图说明四种霉菌的形态特征(有无横隔)。根霉：假根、匍匐菌丝、孢囊梗、孢子囊及孢子囊孢子毛霉：菌丝、孢囊梗、孢子囊及孢子囊孢子青霉：菌丝、分生孢子梗、帚状分支小梗及分生孢子曲霉：菌丝、足细胞、分生孢子梗、初生小梗、次生小梗、顶囊、分生孢子实验结果绘图说明你所观察到的放线菌和霉菌的形态特征。思考题镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？你主要根据哪些形态特征来区分四种不同的霉菌？实验三油镜的使用、细菌的单染色及革兰氏染色（一)、油镜的工作原理增加照明强度当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，降低了视野的照明度；若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。增加显微镜的分辨率：

D=λ/2NA=λ/2n·sin(α/2)D：分辨率NA：物镜的数值孔径值：可见光的波长（平均0.55m)n:物镜和被检标本间介质的折射率：镜口角（即入射角）显微观察低倍镜观察高倍镜观察油镜观察在待观察的样品区域滴加香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中。显微镜用毕后的处理上升镜筒，取下载玻片；用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸沾取少量乙醇乙醚洗液擦去镜头上残留的油迹，最后用干净的擦镜纸擦去残留的乙醇乙醚洗液；用擦镜纸清洁物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件；将镜体各部分复原。

（二）简单染色法目的要求学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法；初步认识细菌的形态特征；巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。基本原理借助物理因素（如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等）和化学因素（如：正负离子之间的相互吸引等）的作用而进行的。实验器材菌种大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物枯草芽孢杆菌12-18h营养琼脂斜面培养物藤黄八叠球菌约24h营养琼脂斜面培养物染色剂草酸铵结晶紫染液番红染液仪器或其他用具显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、无菌水等。操作步骤涂片干燥固定染色镜检水洗干燥实验结果根据观察结果，绘出细菌形态图。思考题你认为在制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？如果你的涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？（三）革兰氏染色法目的要求学习并初步掌握革兰氏染色法；了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。实验器材菌种枯草芽孢杆菌12-18h营养琼脂斜面培养物大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物藤黄八叠球菌约24h营养琼脂斜面培养物染色剂草酸铵结晶紫染液卢戈氏碘液95%乙醇番红染色液仪器或其他用具显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、无菌水等。操作步骤藤黄八叠菌纯培养的镜下形态（革兰氏染色）大肠杆菌纯培养的镜下形态（革兰氏染色）实验结果列表说明你所观察到的细菌形状、颜色和革兰氏染色反应。思考题你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？实验五

微生物大小的测定、显微镜直接计数法目的要求学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法明确血细胞球计数板计数的原理。掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。实验原理镜台测微尺为中央部分刻有精确等分线的载玻片，将1mm等分100格，每格长0.01mm。只用于校正目镜测微尺。目镜测微尺是可放入目镜内的圆形小玻片，精确等分50小格或100小格。由于不同显微镜或不同目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，测量前需先用镜台测微尺进行校正。

球菌以直径表示大小；杆菌用宽×长表示。实验器材菌种：啤酒酵母仪器：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板（一）酵母菌大小的测定安装目镜测微尺校正目镜测微尺将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。分别在低、高倍镜、油镜下用镜台测微尺校正目镜测微尺计算镜台测微尺：将1mm等分为100小格，每小格长0.01mm（即10μm）。目镜测微尺每格长度（μm）=（两重合线间镜台测微尺格数×10）/两重合线间目镜测微尺格数菌体大小测定取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，在高倍镜下测定酵母菌的长和宽。选择有代表性的10个细胞进行测定，取平均值。实验结果记录1）将目镜测微尺校正结果填入下表接目镜放大倍数：——接物镜接物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度/um低倍镜高倍镜油镜2）将啤酒酵母测定结果填入下表测定次数目镜测微尺每格代表的长度/um宽长菌体大小范围/um目镜测微尺格数宽度/um目镜测微尺格数长度/um12345678910（二）酵母菌的显微镜直接计数血球计数板的构造血球计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各有一个方格网。每个方格网共分9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度有两种规格：一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论哪种规格，每个大方格都由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，则每个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。制备适当浓度的菌悬液取洁净的血球计数板盖上盖玻片静置5分钟用高倍镜计数加样品设5个中方格的总菌数为A，菌液稀释倍数为B计数板为25个中方格：1ml菌液的总菌数=A/5×25×104×B计数板为16个中方格：1ml菌液的总菌数=A/5×16×104×B注意事项取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡；一般样品稀释度要求每小格内约有5-10个菌体为宜；每个计数室选5个中格（4个角和中央）计数；位于格线上的菌体一般数上不数下，数右不数左；若芽体大小达到母细胞的一半，则作为两个菌体计数。血球计数板使用完毕，用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，以免损坏网格刻度；洗净后自行晾干或吹风机吹干。实验结果测定你所制备的样品的含菌量。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数各中格中菌数

A

B二室平均值菌数/um12345第一室第二室思考题为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？实验五

培养基的制备与灭菌一、培养基的制备目的要求明确培养基的配制原理通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤按培养基的用途分基础培养基鉴别培养基选择培养基按培养基的物理状态分固体培养基半固体培养基液体培养基按成分不同分天然培养基合成培养基半合成培养基基本原理四种培养基的配方牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（一种天然培养基，用于分离和培养细菌）

配方：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g水1000mlpH7.2-7.4灭菌121℃20min

乳糖蛋白胨培养液（一种液体培养基，用于大肠菌群的生理生化鉴定）配方：牛肉膏3g

乳糖5g

氯化钠5g

蛋白胨10g

水1000ml1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1ml

先将药品溶解于1升水中，后调pH7.2～7.4，加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装入有小倒管的试管中，115℃20min灭菌产硫化氢培养基，一种半合成培养基，用于肠道细菌的生理生化鉴定。配方：柠檬酸铁胺4g蛋白胨20g氯化钠5g

硫代硫酸钠

0.5g琼脂20g水1000mlpH7.2灭菌115℃15min

伊红美兰培养基（一种鉴别培养基，用于大肠菌群的生理生化鉴定）配方：磷酸氢二钾2g

乳糖10g

蛋白胨10g

琼脂20g

水1000ml2％伊红水溶液20ml0.5％美蓝水溶液13mlpH7.2～7.4

灭菌115℃20min器材溶液或试剂

4mol/LNaOH，1mol/LHCl，牛肉膏蛋白胨培养基、乳糖蛋白胨培养液、产硫化氢培养基的配方药品。仪器或其他用具

试管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，药匙，电磁炉，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH5.5～9.0)，硅胶塞，棉花，报纸，记号笔等。操作步骤（一）1．计算：根据配方按照用量计算。2.称量：3．溶解：如有琼脂，要不断搅拌避免糊底。4、调节pH：用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节，以pH试纸或pH计测定。5．过滤：趁热用四层纱布过滤。

操作步骤（二）6.分装试管：固体不超过试管高度的1/5；液体、半固体不超过试管高度的1/4或1/3。三角烧瓶：总体积的一半为限。管口或瓶口不得沾有培养基操作步骤（三）7.加塞1.正确；2.管内部分太短，外部太松；3.外部过小操作步骤（三）8.包扎：注明培养基的名称。9.灭菌

：按各自培养基灭菌的温度、时间灭菌。10.搁置斜面

(1/3～l/2，不能超过1/2)。11.无菌检查了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。

目的要求二、消毒与灭菌

灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。

基本原理干热灭菌火焰灼烧法干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法）湿热灭菌法加压蒸汽灭菌法紫外线灭菌法微孔滤膜过滤除菌火焰灼烧法直接在火焰上灼烧灭菌主要用于实验室接种针(环)、试管口、三角瓶口和金属小工具等的灭菌。干热灭菌法设备：电热烘箱适用于耐高温器皿，160-170℃，维持2小时注意事项：温度不可超过180℃，以防玻璃器皿上的棉塞及包装纸烤焦着火。灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。电烘箱内温度＜70℃时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。2.湿热灭菌(一）高压蒸汽灭菌法：是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内0.1MPa，121℃保持15～30min进行灭菌，从而导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。原因一：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。

卵白蛋白含水量/%30分钟内凝固所需温度/℃50562574~801880~9061450160~170蛋白质含水量与凝固所需温度的关系原因二：湿热的穿透力比干热大。原因三：湿热的蒸气有潜热存在。间歇灭菌法：

应用于不易于高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，每天加热100℃30min、连续三天，可彻底灭菌。煮沸消毒法：注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般煮沸消毒时间为10～15min。超高温杀菌：

此法指在温度和时间标准分别为135～150℃和2～8s的条件下对牛乳或其他液态食品进行处理的一种工艺。2.湿热灭菌(二）高压蒸汽灭菌法（以手提式高压蒸汽灭菌锅为例）

操作步骤（三）全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅1.装锅先向外层锅内加入适量的水，放入内锅，装入待灭菌物品。2.加盖将盖上的排气软管插入内层灭菌锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。3.灭菌加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，升温至l21℃时维持15~20min。4.降温取物

灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，开盖取物。操作步骤（三）加压蒸汽灭菌法0.1MPa，121℃，20min灭菌注意事项：切勿忘记加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。灭菌全程必须有人看守。紫外线灭菌法适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。若紫外线照射与3%~5%的石炭酸溶液或2%~3%的来苏尔等化学消毒剂结合使用，可加强灭菌效果。注意事项：紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。过滤除菌法适用于不耐热的液体物质（如维生素、血清、酶等热敏性物质）。滤膜孔径：≤0.22μm缺点：无法去除培养液中的病毒和噬菌体。思考题培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题？为什么？为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较方案。在高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？实验六水体中细菌总数测定与大肠菌群生理生化反应（一）水体中细菌总数测定目的要求1.了解水样的采取方法2.应用平板菌落计数法测定水样细菌总数基本原理

通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液（使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞在），再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的选择性培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克或每毫升样品中的微生物数量。实验器材菌种：大肠杆菌菌悬液培养基：牛肉膏蛋白胨培养基仪器或其他用具：1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5mL无菌水的试管、吸耳球、培养箱等。操作步骤（一）水样的采集（了解）1.自来水：水龙头火焰灼烧3min→放水5min→用灭菌三角瓶接水→分析2.池水、河水或湖水：将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水面下10-15cm处→翻转过来，除去玻璃塞→取水→盖好瓶塞，取出→冰箱中保存或立即检查操作步骤（二)细菌总数测定（两种方法）倾注法（本次实验采用）涂布法1.编号：取无菌平皿9个，分别表明10－3、10-4、10-5（稀释度）各三套。另取无菌水5支，依次标明10－1、10-2、10－3、10-4、10-510-310-410-5原样10-110-210-310-410-50.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.2ml0.2ml0.2ml2.稀释:放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只接触一个稀释度。3.取样4.倒平板：倒入融化后冷却至45℃的培养基15ml，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。5.培养：37℃倒置培养18～24h实验结果记录稀释度10-310-410-5平板123123123菌落数平均菌落数计算方法细菌总数（个/ml）书P363稀释度选择及菌落总数报告方法例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比值菌落总数(个/ml)报告方式(个/ml)10-110-21