微生物制片显微观察与检测技术

微生物制片显微观察与检测技术显微操作显微镜是微生物检验中最常用的精密光学仪器。显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。食品微生物检验中最常用的是普通光学显微镜。显微镜的使用方法

用光学显微镜观察微生物形态时，一般遵循先低倍镜观察，后高倍镜观察，再油镜观察。

低倍镜操作方法1.两眼从侧面注视低倍物镜对准通光孔，使用粗调焦螺旋将镜筒自上而下的调节，避免物镜镜头接触到玻片而损坏镜头和压破玻片。当物镜镜头与载物台的玻片相距2～3mm时停止；2.左眼注视（注意右眼应该同时睁着），并转动粗调焦螺旋，使镜筒徐徐上升，直到看清物象为止；3.再用微调焦螺旋调至清晰。

注意：粗调调焦螺旋只用于上调载物台，如观察显微镜时，用粗调节器调节，有压碎载玻片、损坏物镜的危险。因此，用细调焦螺旋调节视野使其更清晰高倍镜操作方法1.将低倍镜观察到的目标移动至视野中央；2.将低倍镜镜头转换成高倍镜镜头。换用高倍镜后，视野内亮度变暗，因此一般选用较大的光圈并使用反光镜的凹面；3.用微调焦螺旋调至清晰。观看的物体数目变少，但是体积变大。

注意：高倍镜观察时，光线需增强。油镜操作方法1.将高倍镜观察到的目标移动至视野中央；2.将高倍镜镜头挪开，于载玻片上滴一滴香柏油；3.将油镜镜头移动至视野，让油镜镜头浸入香柏油（至油晕不再扩大为止）；4.用微调焦螺旋调至清晰。

注意：油镜的操作需要较强的关线，故需将光线调至最强。用10倍和/或40倍物镜为随后的高倍油镜（90倍或100倍）选择合适的视野（油镜镜筒上通常刻有H.I.OIL或OEL等标志）油镜用后的处理：第一遍：用擦镜纸拭去镜头上的油；第二遍：用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去头上残留的油迹；第三遍：再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。普通显微镜的保养

(1)观察完后，移去观察的载玻片标本。(2)用过油镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。(3)转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。

(4)将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。镜头清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸，物镜的清洗，可选用不同的溶剂，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。

染色方法(一)简单染色法简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，观察细菌的形态。(二)复染色法

用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G―表示细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。实验材料1.显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯、蜡笔等。2.草酸铵结晶紫染液、碘液、95％乙醇、蕃红染液、石炭酸复红染液3.菌株：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌实验内容与步骤(一)细菌的简单染色步骤涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检1．涂片取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量培养物与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。2．干燥涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

3．固定手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过2~3次，共约2~3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。4．染色在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。5．水洗斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。6．干燥用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。

7．镜检(二)细菌的革兰氏染色步骤

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察1．取培养物分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。2．用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。3．加碘液媒染1min后水洗。4．斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20~30s，随即水洗。5．用蕃红染液复染1min，水洗。6．用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。革兰氏染色图解革兰氏染色试剂

步骤1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上

步骤2：用无菌操作法取少许培养物于蒸馏水滴上

步骤3：用接种环将培养物涂布成一薄层

步骤4：风干

步骤5：在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次固定步骤6：结晶紫染色1分钟

步骤7：用蒸馏轻轻冲洗玻片

步骤8：革兰氏碘液染色1分钟，再用蒸馏水轻轻冲洗

步骤9：酒精脱色至下滴液为无色，立即用蒸馏水冲洗

步骤10：番红复染1分钟，用蒸馏水轻轻冲洗

大肠杆菌（Escherichiacoli）革兰氏染色图

革兰氏染色阴性杆菌（红色）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）革兰氏染色

革兰氏染色阳性球菌（紫色）

注意事项1．革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。2．选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3.干净的玻片、热固定、每一步水洗要彻底并且吸干等也是实验成功的关键。微生物检测技术介绍检测技术的重要性革兰氏染色镜鉴按照标准进行传统的生化反应鉴定API试剂条菌鉴定国际金标准

半自动细菌鉴定仪（ATBExpression）

全自动细菌鉴定仪（VITEK2）微生物鉴定MiniVIDAS筛选系统免疫凝集/免疫沉淀实验微生物检测实时荧光定量PCR色谱、光谱分析技术分子生物学技术一、微生物检验技术介绍传统筛选系统微生物的检测技术c)酶联免疫荧光技术d)实时荧光定量PCRe)免疫磁珠技术b)乳胶凝集反应a)常规培养鉴定法—显色培养基法

显色培养基

显色培养基检测基本原理：利用不同种属细菌代谢所产生的酶的特异性，在培养基中加入相应的特异性酶底物和抑制剂，当具有某特异酶的细菌与酶底物作用时，使显色基团游离出来附着于菌落上，形成颜色独特的菌落。根据菌落的颜色直接对菌属（种）作出鉴定。

GB4789-2008、2010

中新技术的应用-显色培养基

沙门氏菌志贺菌副溶血性弧菌O157：H7大肠埃希菌单增李斯特菌阪崎肠杆菌大肠杆菌计数显色培养基的优势快速、简便、节省时间-大多数显色培养基只需在样品增菌后，分离培养18~24h，即可根据菌落的颜色作出初步的鉴定。（阴性-弃去；阳性-进一步鉴定）。结果直观，一目了然（根据颜色判定结果）。灵敏度高、特异性强，大大减少了后续的鉴定步骤（确证试验）。显色培养的缺陷假阳性：97%的大肠埃希菌含有β-葡萄糖苷酶，约10%的沙门氏菌属中也含有此酶。假阴性：O157：H7大肠埃希菌没有β-葡萄糖苷酶，在MUG-LST上呈阴性反应。不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培养基中呈阳性反应。提示：这是任何选择性培养基都无法避免的问题。与普通选择性培养基比较，显色培养基的假阳性、假阴性的机率相对要低得多。

乳胶凝集反应

原理：乳胶凝剂试验是以乳胶微粒为载体的间接凝集试验。用人工方法将抗体包被于与免疫无关的大分子聚苯乙烯或羧化聚苯乙烯乳胶颗粒上。利用抗原抗体特异性结合的特性，当敏感的乳胶颗粒与待检细菌菌悬液混合后，迅速形成肉眼可见的凝集团块，用于筛选可疑菌。

常用Microgen乳胶凝集试验盒

李斯特菌（listeria）沙门氏菌（salmonella）弯曲杆菌（camylobacter）大肠杆菌O157（E.coliO157）军团菌（legionella）葡萄球菌（staph）

观察凝集结果全自动荧光免疫分析仪(VIDAS-mini或30)检测项目：食品及环境中常见致病性细菌（李斯特菌属、单核增生李斯特菌、弯曲菌属、大肠埃希菌O157、沙门氏菌属、葡萄球菌肠毒素检测）的快速筛检全自动荧光免疫分析仪(VIDAS)原理：

以免疫技术捕获目标微生物，应用酶联免疫法，最后测蓝色荧光（ELFA）。包被针上有抗体包被，所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。特点：结果准确：对每个标本做两次免疫反应，保证结果的可靠。灵敏度比可见光方法高出1000倍。已获得美国FDA、日本厚生省、AOAC、USDA、中国进出口商品检验局等政府及权威机构认可。可同时进行12个相同或不同的测试。每天进行约60—80项测试特异性强：标本不需分离出目标微生物即可上机检测。避免交叉污染：没有采样针，避免标本之间交叉污染；样品不与仪器接触，仪器内没有抽吸样品的管路，杜绝了标本对环境的污染荧光定量PCR聚合酶链式反应技术（PCR）是分子生物学技术最具有代表性的技术。它是一种能在体外将微量生物DNA分子进行数百万倍放大的新型检测技术。荧光定量PCR技术在普通PCR技术基础上，通过荧光染料的结合，将检测信号进一步放大，其灵敏度是普通PCR的几百倍，扩增和检测过程由仪器自动完成，检测同量高，速度快除去样品前增菌时间，2-4小时内可得到检测结果微生物检测限可能达到1copy，抗杂菌干扰能力强

免疫磁珠技术由于受到抽样数量、检验方法和试验取样量的限制，无法将全部样品进行检查。磁珠分离技术，能简单快速地捕捉特异的蛋白、遗传物质和其他生物分子。通过免疫磁珠富集手段，将微量的目标物质通过磁珠富集到可检测的水平。这一技术不仅可应用于致病微生物的检测，还可用于食品中致敏原蛋白质、核酸以及各类细菌毒素的富集，应用范围广阔，适宜高通量、全自动操作。Principle:ImmunomagneticMicroparticleSeparation/ConcentrationofBacterialCellsNBioLumixTM微生物实时快速检测系统是最新推出的用于食品、保健品、乳制品、肉制品、饮料、化妆品、洗化产品和制药等工业领域和监管部门等使用的微生物快速检测系统。可以快速确定样本中细菌总数、大肠菌群/大肠杆菌、致病菌、霉菌等的存在与数量。BioLumixTM实时快检系统----简便、快速并可降低微生物试验的操作成本。-装有增菌培养基和指示剂的检测管。-数小时内得到检测结果（而非数天）-结果易解释并自动传输到需要快速发运安全产品的地方。-非微生物专业技术人员也能够操作。可检测的项目:大肠菌群大肠杆菌肠杆菌科革兰氏阴性菌乳酸菌酵母菌和霉菌假单胞菌蜡样芽胞杆菌葡萄球菌沙门氏菌卫生监控保质期预测腐败菌检测无菌检验挑战实验微生物限定检测嗜热菌计数嗜冷菌计数抗生素残留检测生物体可以在BioLumix仪器中进行孵育，孵育温度可以在15