【课件】3.2基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第节2基因工程的基本操作程序高中生物选择性必修3第3章阐明基因工程的原理和基本操作程序。针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物学习目标一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的基因例如，与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因等。2、获取目的基因的常用方法有哪些?（一）人工合成（DNA合成仪）（二）利用PCR技术扩增（三）从基因文库中获取（一）通过DNA合成仪用化学方法人工合成DNA合成仪蛋白质的氨基酸顺序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推测推测合成

当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。DNA合成仪1、概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因。

整个过程是在体外进行，故又叫做体外DNA扩增技术。聚合酶链式反应体外特定DNA片段2、PCR利用的原理是什么？DNA复制（二）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）3、方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）

指数2n（2）4种脱氧核苷酸(dNTP)

（5）一对引物：（3）热稳定DNA聚合酶(Taq酶）（1）DNA模板(需含有目的基因)

5、条件：引物是一段核苷酸序列，与目的基因的起始段互补。有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。4、前提：（4）温度控制IMN变性复性延伸PCR扩增过程是怎样的？PCR过程（三次）925575℃延伸925575℃变性925575℃退火925575℃3`5`5`3`Taq聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因925575℃变性3`5`5`3`925575℃退火925575℃延伸925575℃变性925575℃退火925575℃延伸925575℃变性925575℃退火925575℃延伸PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，

断裂，形成_______

b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，从引物的___________延伸，合成与模板互补的___________。氢键单链DNA双链DNA链5′端→3′端测一测（三）从基因文库中直接获取（拓展）1.什么是基因文库？2.按外源DNA片段的来源分类基因文库分为哪几类？种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库3.建构基因文库的目的是什么？为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。4.怎样从基因文库中得到我们所需要的目的基因？★基因文库的构建（1）基因组文库的构建提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）基因组文库（2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成与载体连接导入受体菌群mRNA逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA(cDNA)该生物cDNA文库第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。

基因组文库和部分基因文库质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA——核心二、基因表达载体的构建（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出_________。（2）用_____________切断目的基因，使其产生_________________。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种限制酶

目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。

科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:开阔眼界：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：开阔眼界：2.真核细胞的基因结构1、基因表达载体的组成：2、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因三、将目的基因导入受体细胞1、转化：2、分类（一）将目的基因导入植物细胞（二）将目的基因导入动物细胞

（三）将目的基因导入微生物细胞

目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。受体细胞稳定表达（一）将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法（采用最多）（2）基因枪法（3）花粉管通道法1、方法（1）农杆菌转化法（采用最多）①农杆菌转化法的原理是什么？②农杆菌转化法适用于那些植物？1、方法：显微注射法（采用最多；最有效）（二）将目的基因导入动物细胞2、操作的程序是怎样的？1、为什么选用微生物作为受体细胞？（三）将目的基因导入微生物细胞2、操作的程序是怎样的？3、什么是感受态细胞？用什么处理得到？2023/2/2四、目的基因的检测与鉴定目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。1.分子水平的检测（1）PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA

在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出相应的mRNA。2023/2/2（2）抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。

从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。2.个体生物学水平的检测转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）感染（抗病接种实验）未出现病斑盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常2023/2/21.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？到社会中去

科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。2023/2/22.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？到社会中去

科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基2023/2/2到社会中去因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全生评价等。2023/2/2探究·实践·DNA片段的扩增及电泳鉴定（一）实验原理1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。2.DNA片段电泳鉴定的原理：（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。（3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量为1pg-1μg）5～10μL总体积50μL2023/2/2（二）材料用具1.试剂：（1）无菌水、琼脂糖；（2）电泳缓冲液（TAE或TBE）；（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。（5）PCR反应体系的配方2023/2/22.用具：（1）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）；（2）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）；（3）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）；（4）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）；（5）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）1.DNA片段的扩增移液用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分离心待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）反应参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min可根据目的片段长度适当调整延伸时间2023/2/2（三）方法步骤预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。配制琼脂糖溶液根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀制备凝胶将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜加样将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物电泳接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相2023/2/22.DNA片段的电泳鉴定2023/2/2（四）注意1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。2023/2/2结果分析与评价1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。

可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。

如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。总结:基因工程的基本操作程序获取目的基因人工合成利用PCR从基因文库构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞植物细胞、动物细胞、微生物细胞目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；思考探究2、利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？

有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因，如绿色荧光蛋白基因等3、β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。当堂检测1.

下列不属于获得目的基因的方法的是（）从基因文库中获取B.利用人工合成法获得C.利用PCR技术大量获得D.利用农杆菌转化法获得 【答案】D【解析】基因工程中获取目的基因的方法有三种：从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因、人工合成法（包括反转录法和化学合成法）获得目的基因。2.聚合酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述若干次循环：90℃以上使模板DNA解聚为单链→50℃左右下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR反应过程的叙述中，不正确的是（）A.变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B.复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成C.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D.PCR技术与细胞内DNA复制相比，所需要酶的最适温度较高【答案】C【解析】聚合酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，相当于DNA的大量复制。所以在形成新的DNA过程中，所需要的原料是四种脱氧核苷酸。A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B.基因表达载体的构建并不一定相同C.图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体识别和结合的部位D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因 【答案】C【解析】由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。3.

下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是（）4.下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是（）A.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与 【答案】A【解析】⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A项正确；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T-DN