菌种选育、保藏与复壮2

五、原生质体融合定义：

通过酶解作用将两个亲株的细胞壁去除，在高渗条件下释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体。然后将两亲株的原生质体在高渗条件下混合，加入融合促进剂聚乙二醇、仙台病毒或电融合等助融，使它们相互凝集。通过细胞质融合，促使两套基因组之间的接触、交换、遗传重组，在适宜条件下使细胞壁再生，在再生的细胞中获得重组体。(1)(1)(2)(3)(4)原生质体的融细胞杂交原生质体融合回本章目录（一）原生质体融合技术的特点1、重组频率较高2、受接合型或致育性的限制较小3、重组体种类较多4、遗传物质的传递更为完整5、采用温度、药物或紫外线照射等处理钝化一方亲株的原生质体，然后再与另一亲株的原生质体融合，可去除一方亲株，提高筛选效率6、与其他育种方法结合，提高筛选效率（二）原生质体融合的主要骤标记菌株的筛选原生质体的制备原生质体再生试验原生质体的融合筛选稳定的融合子优良菌株的筛选

1、标记菌株的筛选

选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株

为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性、菌落特征、细胞形态等.

抗青霉素，菌落小对青霉素敏感，菌落大抗青霉素菌落大

革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成溶菌酶微球菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌革兰氏阴性菌不能直接溶壁，只有当乙二胺四乙酸（EDTA）存在时，某些革兰氏阴性菌的细胞壁才能够被溶菌酶溶解。2、原生质体制备

放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成青霉菌多用纤维素酶和-1,3-糖苷酶等溶壁曲霉用-1,3-糖苷酶和-1,4-糖苷酶等酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质蜗牛酶菌体的前处理在菌体生理状态酶的浓度菌龄：对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。酶解温度影响原生质体制备的因素酶解时间渗透压细菌中加入EDTA,甘氨酸、青霉素等，放线菌加入甘氨酸，可直接影响细胞壁正常合成以原生质体形成率和再生率之积达到最大的酶浓度为最适酶浓度。常用酶解范围为20~40℃，具体情况具体分析通过实验选择适宜酶解时间保持稳定的等渗透压至关重要，可采用渗透压稳定剂：细菌用蔗糖、氯化钠；霉菌用氯化钾、氯化钠等。原生质体形成率=破壁前菌数-低渗处理后剩余菌数破壁前菌数×100%3.原生质体再生试验使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构酶解除去细胞壁后的原生质体应具有再生能力，即能重新长成胞壁，恢复细胞形态，并能正常生长繁殖，这是原生质体融合的必要条件.原生质体再生率=再生平板计数—低渗剩余菌数破壁前菌数—低渗剩余菌数×100%再生率

细菌为3-10%真菌在20-80%不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压4.原生质体融合聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合一般PEG的使用浓度范围在25-60%采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合影响原生质体融合的因素有：促融剂的浓度、作用时间、阳离子浓度和pH等。当然更重要的是亲株本身特性的选择，以及尽可能制备具有活力的原生质体。

微生物原生质体融合的一般原理和过程

原生质体经过融合得到的融合细胞出现两种情况，一种是真正的融合，产生杂合二倍体(融合后的二倍体细胞分裂而不分离，分裂后的细胞仍保持二倍体状态)或单倍重组体；第二种情况是暂时的融合，形成异核体。5．融合子的选择一融合子的遗传分析

重组子的检出方法有两种：直接法将融合液涂布在补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子。间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。6.优良菌株的筛选

通过两亲株遗传标记的互补而得以识别两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-

。六、基因工程技术基因工程是现代生物工程技术的重要组成部分。基因工程又称为遗传工程、DNA重组技术、基因克隆。基因工程的出现使遗传学实现了一个巨大的飞跃，使遗传学及育种研究可以按照人们的愿望有计划地实施和控制。六、基因工程技术1、含目的基因DNA片断的制备。2、选择合适的载体。3、带有目的基因的DNA片断与载体连接。4、将重组的DNA分子导入受体细胞，

在受体细胞内扩增。5、筛选和鉴定出带有重组DNA的转化细胞。6、表达、鉴定外源基因的表达产物。

体外重组DNA技术基因重组转化4.基因工程

回本章目录（二）DNA重组的操作1、含目的基因DNA片断的制备(1）限制性内切酶(2)目的基因DNA片段的获得

由两个主要途径获得：一是从具有此基因片段的生物体染色体中分离二是根据已知的氨基酸顺序或已有的互补RNA进行合成。

2、基因工程常用的载体

载体是指在克隆其他DNA片断时使用的运载体，与外源DNA片段连接后也能在受体细胞中复制。(1)载体的种类：用于基因工程的载体有三类：质粒载体；噬菌体载体；根据特殊要求构建的载体

(2)质粒的制备质粒制备分三步进行：细菌培养和质粒扩增；细菌细胞收集和裂解；质粒DNA提取。1）

质粒（plasmid）

质粒是能自主复制的双链环状DNA分子，在细菌中独立于染色体之外而存在，存在普遍，几乎所有细菌株系都含有质粒。高拷贝数质粒：质粒在宿主中有10~100个拷贝低拷贝数质粒:质粒在宿主中只有1~4个拷贝

质粒的特点1）

质粒（plasmid）

质粒的特点质粒回本章目录基因工程对质粒的要求构建一种质粒载体,对质粒通常有以下几个方面的要求:①质粒载体的相对分子质量应尽可能小。实验证明，质粒大于15kb时，其将外源DNA转入大肠杆菌的几率就会大大降低；②在宿主细胞中能自主复制和稳定地遗传③应该有用来克隆外源DNA的单一的限制性内切酶识别位点④具有明显的筛选标记⑤能转化比较广的宿主细胞3．目的基因与载体的连接得到目的基因与载体后，把它们相互连接即进行体外人工重组，其连接有4种方式。

(1)黏性末端连接(2)平头连接(平齐末端连接)

(3)同聚末端连接——加接头(4)人工接头(人工黏性末端)4．重组DNA引入宿主细胞重组DNA只有进入受体细胞才能进一步实现扩增和表达。

5．重组体的筛选和表达产物的鉴定(1)重组体的筛选(2)表达产物的鉴定（三）微生物基因工程的应用1、常规发酵工业

可通过基因工程获得工程菌。2、提高菌种产量3、生产重要药物中间体的工程菌4、基因工程药物开发5、环保、生物固氮等。第二节菌种保藏与复壮菌种保藏：(1)目的：

①存活，不丢失，不污染②防止优良性状丧失

③随时为生产、科研提供优良菌种

(2)原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺乏营养以及添加保护剂等）

二.菌种的复壮rejuvenation

狭义复壮

在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；广义复壮

在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种，也称生产育种。菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。菌种的复壮措施：

①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。

②通过寄主体内生长进行复壮（如Bt、白僵菌、多角体病毒等的复壮）；

③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。

④采用有效的菌种保藏方法。（1）划线法：简单、快捷。（2）稀释法：菌落单一均匀。

纯种分离方法一、固体培养基四区划法接种法接种针先以火焰灭菌法灭菌

步骤一轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却

步骤二以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。

步骤三更换一个新的无菌营养平板

步骤四将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区。步骤五重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤六由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。步骤七重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。

步骤八重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。步骤九

在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。步骤十固体培养基的稀释涂抹接种法需要使用的仪器——震荡机

吸取准备好欲稀释的菌液取含有9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将试管于震荡机上，使菌液混合均匀取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL，加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。

从最后稀释菌液中吸取0.1mL菌液，置入准备好的无菌琼脂内。将三角玻璃棒浸于酒精中

将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）

使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。

4.生产性能的测定

一般采用两步法：

初筛：以量为主

复筛：以质为主菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构：

中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)

美国的典型菌种保藏中心(ATCC)

英国国家典