第十四章 基因工程及其在医学中的应用

同学们上午好主讲叶辉单位温州医学院生化教研室上节课的重点内容1.掌握真核基因表达调控的特点；2.掌握顺式作用元件、反式作用因子的概念及组成和转录因子的分类.复习与巩固

是指利用重组DNA技术将目的基因和载体重组，再导入受体细胞内进行扩增和表达的过程。一.基因工程(geneticengineering)第一节基因工程基因工程相当于目的基因的无性繁殖过程，也称其为基因克隆(geneclone)或分子克隆（molecularclone）。

第14章基因工程及其在医学中的应用重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNAT4DNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移、制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等逆转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化（连），或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除5‘末端磷酸基，防止载体自身连接。二、基因工程操作中常用的工具

（一）工具酶

限制性内切酶(restrictionendonuclease)

定义:是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基序列的核酸水解酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ

Ⅱ型限制酶识别序列特点—回文结构

GGATCCCCTAGG

一般识别双链DNA的4～8个核苷酸顺序，其中以6个核苷酸顺序最为常见。EcoRⅠGTTCAAGCTTAAAATTCG+GAATTCCTTAAGHpaⅡGTTAACCAATTGAACTTG+平端切口粘端切口（5’和3‘突出端）切口：黏性切口和平端切口（二）载体1.定义：是携带目的DNA片段进入受体细胞进行扩增和表达的工具。2.分类：(1)克隆载体(cloningvector):使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。(2)表达载体(expressionvector):使插入的外源DNA序列转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。质粒

(plasmid)特点存在于细菌等细胞质中双链环状DNA分子大约1-200Kb具有自主复制和转录能力不能独立存活

在子细胞中保持恒定的拷贝数并表达其遗传信息常用载体：细菌质粒噬菌体黏粒病毒特点：多克隆位点筛选标记三、基因工程的操作过程基本过程目的基因的获取重组DNA分子导入受体细菌目的基因与载体的连接克隆(或表达)载体的选择和构建重组体的筛选与鉴定克隆基因的表达

和表达产物纯化以质粒为载体的DNA克隆过程目录（一）目的基因的获得1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录基因组DNA文库cDNA文库粘性末端连接

（二）目的基因与载体的连接BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端导入种类载体宿主转化质粒细菌转染噬菌体或病毒真核细胞转导噬菌体细菌转化、转染和转导的区别（三）重组体导入受体细胞BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体目的基因自连载体自连（四）基因工程菌的筛选直接选择法：

抗药性标记选择蓝白斑筛选法

菌落或噬菌体的原位杂交非直接选择法：免疫学方法(插入失活法)抗药性标记选择目录重组DNA技术操作过程可形象归纳为

小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交（五）外源基因的表达种类功能所含特异序列克隆载体外源基因扩增复制子多克隆位点筛选标志表达载体外源基因表达复制子多克隆位点筛选标志基因表达的调控序列克隆载体和表达载体的比较

分子杂交以DNA的变性和复性为理论基础。DNA变性：DNA在某些理化因素的作用下碱基对间氢键破坏，由双链变成单链的过程。DNA的复性：变性DNA的单链重新合成双链的过程。分子杂交：不同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合双链的过程。分子杂交

第二节常见分子生物学技术

一、分子杂交（molecularhybridization）

复性RNADNA（一）核酸探针（probe）

1、定义：

是分子杂交的技术基础，它是一段与被检测核酸序列互补的带有标记的核苷酸片段，长度一般为十几到几千个碱基不等。

2、探针标记方法：（1）放射性同位素标记（2）光敏生物素标记（3）地高辛标志物（4）分子信标（二）分子杂交的方法斑点杂交(dotblothybridization)

DNA点阵（DNAarray）

基因芯片

（genechips）

原位杂交(insituhybridization)

转移印迹技术变性DNA或RNA探针杂交液NC硅片（三）印迹技术的类别及应用1、DNA印迹技术

(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。2、RNA印迹技术

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。3、蛋白质的印迹分析

(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及相互作用研究。

分子杂交实验①②③

二、聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C95˚C55˚C72˚CPCR的主要用途（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）测定基因的表达水平三、DNA的序列分析放射自显影凝胶电泳碱性专一性裂解反应A/GGC/TC5’GTCGTAA5’GTCGTA5’GTCGT5’GTCG5’GTC5’GT5’G--+硫酸二甲酯——G甲酸——A/G肼——C/T肼（NaCl）——C（一）化学裂解法(Maxam-Gillbert法)（二）DNA链末端合成终止法四、转基因动物、克隆动物和基因剔除技术

（一）转基因动物定义

是利用基因工程和胚胎工程技术，改变动物遗传性状的新方法，是将外源基因导入动物受精卵，再将受精卵植入到代孕动物的输卵管或子宫中培育的动物。目录（二）克隆动物

核转移技术

将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。多利诞生过程

（三）基因剔除技术也称基因靶向(genetargeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。又称基因敲除（geneknockout）。基因敲入（geneknockin）定义：是指利用分子生物学和分子遗传学的技术方法通过直接检测基因结构是否改变、基因表达有否异常，对疾病作出诊断。基因诊断的概念和特点特点：

针对性强；灵敏度高；适用范围广；早期诊断第三节基因工程在医学中的应用

（一）基因诊断（genediagnosis）

甲型血友病基因组的限制性酶切分析×BclⅠ酶切位点5´5´3´突变基因99bp142bp43bp正常基因

基因治疗的概念早期将通过基因转移技术用正常基因原位置换有缺陷的基因治疗单