观察胶原蛋白对成纤维增殖及小鼠伤口愈合的影响,免疫学论文

观察胶原蛋白对成纤维增殖及小鼠伤口愈合的影响,免疫学论文皮肤损伤创面治疗是临床常见问题,如患者伴有免疫功能低下及糖尿病等疾病,伤口通常较难愈合,怎样促进创面愈合并提高愈合质量一直是研究的热门。创伤修复是由多种细胞、细胞因子介入、且互相作用的复杂经过,胶原蛋白作为细胞外基质重要组成成分可促进多种细胞如成纤维细胞、内皮细胞的迁移、分化和增殖,并可促进生长因子等细胞因子的产生,促进伤口愈合。Chai等发现,将荧光标记的鱼鳞胶原蛋白置于小鼠皮肤外表,鱼鳞胶原蛋白可透过皮肤角质层,并可活化成纤维细胞,加强皮肤的弹性及保湿性。Castillo-Briceo等研究发现:胶原蛋白中的GFOGER、GLOGEN构造域可促进成纤维细胞的黏附、增殖及IL-1基因的表示出。利用胶原蛋白胶制成的敷料治疗糖尿病小鼠皮肤溃疡,治疗第7天,可使伤口缩小62%。当前,天然胶原蛋白主要来源于畜类及禽类动物组织,但由于疯牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆发,使陆生哺乳动物胶原蛋白的安全性普遍遭到质疑。我们国家水产品丰富,在加工鱼产品同时产生大量下脚料,华而不实鱼鳞约占总质量5%,通常被当作垃圾丢弃,我们国家每年丢弃的鱼鳞约有30万吨。蛋白质是鱼鳞的主要成分,约占总重的70%,华而不实主要是胶原蛋白和鱼鳞硬蛋白。本室的前期工作表示清楚,水提法提取的鱼鳞胶原蛋白可去除氧自由基,提高超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)含量,具有良好的生物学活性。在这里基础上,本研究利用水提法提取鱼鳞胶原蛋白,观察胶原蛋白对成纤维增殖及对免疫功能低下小鼠伤口愈合的影响,为鱼鳞胶原蛋白开发利用及损伤修复治疗研究奠定基础。1、材料与方式方法1.1材料鱼鳞取自牡丹江市新玛特超市(新鲜的各种鱼鳞混合物)。BALB/C小鼠,雌雄各半,体重18~20g;3日龄内Wsitar乳鼠,由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。RPMI1640培养基为Gibco公司产品,ELISA试剂盒为RD公司产品,引物由上海生工生物工程有限公司合成,SYBRPremixExTaqTM为TaKaRa公司产品。1.2方式方法1.2.1鱼鳞胶原蛋白膜制备:①鱼鳞前处理:新鲜鱼鳞清水冲洗烘干1%盐酸溶液脱钙清水、蒸馏水冲洗调pH值烘干,备用。②水提法制备鱼鳞胶原蛋白膜:取适量经处理鱼鳞,捣碎,按1∶30比例参加蒸馏水,100℃水浴30min,80℃水浴1.5h,4℃、8000r/min离心20min,取上清,经0.45m滤膜过滤除菌后,于超净台内自然枯燥后即得鱼鳞胶原蛋白膜。③胶原蛋白含量测定:采用对二甲基氨基苯甲醛比色法测定胶原蛋白特征氨基酸-羟脯氨酸的含量,测得值11.1即为胶原蛋白的量。提取率=提取的胶原蛋白量/鱼鳞中总的胶原蛋白量100%。1.2.2鱼鳞胶原蛋白对大鼠真皮成纤维细胞增殖的影响:大鼠真皮成纤维细胞分离:取3日龄内的Wsitar乳鼠背部皮肤,参加0.25%中性蛋白酶溶液,4℃酶解消化过夜,分离真皮、表皮。将真皮部分参加0.25%的Ⅰ型胶原酶37℃酶解消化1h。PBS溶液洗涤离心、200目细胞筛过滤去除基质成分,得到的细胞为大鼠真皮成纤维细胞。MTT法检测鱼鳞胶原蛋白对大鼠真皮成纤维细胞增殖的影响:取适量无菌胶原蛋白膜,用1640培养液溶解制成浓度为5、10、20、40mg/L液体,与生长状态良好的大鼠真皮成纤维细胞4103个共同培养于96孔板中,未加胶原蛋白孔为空白对照。培养48h后,每孔参加MTT溶液(5g/L)20L,继续培养4h。弃上清,每孔参加DMSO溶液150L,振荡10min,于490nm处检测吸光度(OD)值。增殖率E(%)按下面公式计算。E(%)=(A样品-A0)/A0100%(A0为空白对照组吸光度值;A样品为胶原蛋白组吸光度值)。1.2.3免疫低下小鼠皮肤损伤模型制备:利用环磷酰胺诱导小鼠免疫低下。将小鼠腹腔注射环磷酰胺50mg/kg,天天1次,连续2天,建立小鼠免疫低下模型。随机取正常小鼠10只,作为正常组;取免疫低下小鼠40只,随机分为4组(模型组、鱼鳞胶原蛋白1mg、0.5mg、0.25mg组)。乙醚麻醉,背部去毛,消毒,用特制打孔器在小鼠背部打一直径为1cm的圆形孔,切除皮肤全层。造模第1天,正常组、模型组伤口处覆盖无菌纱布,鱼鳞胶原蛋白组伤口处覆盖含量为1mg、0.5mg、0.25mg的鱼鳞胶原蛋白膜,每日更换纱布及给药1次,观察伤口愈合情况,并将创面描记在半透明纸上,计算创面面积大小,按下面公式计算创面愈合率,创面愈合率(%)=(开场创伤面积-未愈合创面面积)/开场创伤面积。1.2.3.1检测PDGF、TGFmRNA表示出:皮肤损伤后第5、7、10天切取模型组、鱼鳞胶原蛋白1mg组、正常组伤口组织,匀浆器研磨,利用Trizol试剂法提取RNA。取1gRNA利用M-MLV逆转录酶法合成cDNA。PCR采用SYBRGreen染料法,PDGF上游引物为5-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-3,下游引物为5-TTGGCCACCTTGACGCTGCCG-3。TGF上游引物为5-GCTAATGTTGTTGCCCTCCTAC-3,下游引物为5-GGACTTTGGTGTGTTGAGTGTC-3。PCR反响条件为:50℃,2min,94℃,10min,1循环;94℃,15s,60℃,1min,40循环。以GADPH为内参基因,用2-Ct法处理数据。1.2.3.2检测PDGF、TGF含量:皮肤损伤后第5、7、10天切取模型组、鱼鳞胶原蛋白1mg组、正常组伤口组织,加适量生理盐水将组织捣碎,4℃、7500r/min离心15min,取上清,按讲明书ELISA检测PDGF、TGF含量。1.2.3.3流式细胞术检测伤口处M2型巨噬细胞含量:皮肤损伤后第10天切取模型组、鱼鳞胶原蛋白1mg组、正常组伤口组织,用适量生理盐水冲洗后,放入含有0.1%胶原酶,300U/mLDNAase的PBS中37℃消化90min,离心取上清,用40%/70%不同密度的淋巴细胞分层液梯度离心,即可得到巨噬细胞。将巨噬细胞与FITC标记的抗小鼠F4/80、PE标记的抗小鼠CD206抗体4℃共同孵育30min,PBS洗涤后,上机检测。1.3统计学处理。应用SPSS17.0软件,通过t检验进行统计学分析,数据以珋xs表示,P0.05为差异有显著性意义,P0.01为差异具有非常显著性意义。2、结果2.1鱼鳞胶原蛋白对大鼠真皮成纤维细胞增殖的影响实验结果显示,鱼鳞胶原蛋白无细胞毒性、具有良好的促进成纤维细胞增殖作用,并呈一定剂量依靠关系,当鱼鳞胶原蛋白浓度到达40mg/L时,增殖率可达38.65%(图1)。2.2鱼鳞胶原蛋白对伤口愈合率的影响与正常组相比,免疫低下小鼠伤口愈合明显延迟缓慢,造模第5天,正常组的愈合率到达25.15%。而免疫低下小鼠的愈合率仅为8.34%。鱼鳞胶原蛋白具有良好的组织相容性,无细胞毒性作用,将鱼鳞胶原蛋白膜覆盖在伤口上,明显促进了免疫低下小鼠伤口愈合。与模型组相比,造模第5天,鱼鳞胶原蛋白1mg组即明显促进了伤口愈合,愈合率已达18.19%(P0.01)。第10天,0.5mg鱼鳞胶原蛋白组可明显促进伤口愈合(P0.05),愈合率达57.37%,1mg鱼鳞胶原蛋白组愈合率已接近正常组。第15天,1mg组愈合率已到达96.34%。鱼鳞胶原蛋白0.25mg组促愈合作用无显著性差异(图2)。2.3鱼鳞胶原蛋白对伤口处PDGFmRNA表示出及合成的影响实验结果显示,与模型组相比,造模第5天,鱼鳞胶原蛋白1mg治疗剂量即可促进伤口处PDGFmRNA表示出。造模第10天,PDGFmRNA表示出水平接近正常组(胶原蛋白组PDGFmRNA表示出量是模型组的2.31倍,正常组的表示出量是模型组的2.38倍,图3)。ELISA检测结果(图4)进一步表示清楚鱼鳞胶原蛋白可促进PDGF蛋白合成。2.4鱼鳞胶原蛋白对伤口处TGFmRNA表示出及合成的影响实验结果显示,与模型组相比,鱼鳞胶原蛋白1mg治疗剂量可促进伤口处TGFmRNA表示出,造模第10天,TGFmRNA表示出水平接近正常组(胶原蛋白组TGFmRNA表示出量是模型组的2.29倍,正常组的表示出量是模型组的2.38倍,图5)。ELISA检测结果(图6)进一步表示清楚,鱼鳞胶原蛋白可通过促进TGF表示出及合成,促进免疫低下小鼠伤口愈合。2.5鱼鳞胶原蛋白对伤口处M2型巨噬细胞含量的影响实验结果显示,与模型组相比,鱼鳞胶原蛋白1mg治疗剂量可促进巨噬细胞向伤口处聚集及向M2巨噬细胞转化。造模第10天,鱼鳞胶原蛋白组伤口处巨噬细胞中M2型巨噬细胞含量可达38.57%,而模型组的含量仅为25.26%(图7)。3、讨论胶原蛋白是细胞外基质重要组成成分,在损伤修复经过中发挥重要作用。当前,天然胶原蛋白提取的主要方式方法为酸法及酶法,但该提取方式方法时间长,成本高,且大量腐蚀性物质对生产设备要求较高,不合适大规模生产。本室前期工作表示清楚:与酸法相比,水提法同样能够有效的提取鱼鳞胶原蛋白,且提取的胶原蛋白具有良好的去除氧自由基,提高SOD、CAT含量作用。本研究采用水提法提取鱼鳞胶原蛋白,观察对免疫低下小鼠伤口愈合作用。成纤维细胞是构成肉芽组织的主要成分之一,能合成、分泌大量胶原蛋白、纤维连接蛋白等细胞外基质,为表皮细胞的覆盖创造条件,还可分泌PDGF、TGF、FGF等多种细胞因子,通太多途径介入修复经过。本研究利用原代培养的大鼠真皮成纤维细胞,观察鱼鳞胶原蛋白对成纤维细胞增殖的影响。结果表示清楚:水提法提取的鱼鳞胶原蛋白具有良好的生物相容性,能够剂量依靠的方式促进成纤维细胞增殖,当浓度到达40mg/L时,增殖率可达38.65%。组织损伤修复是由多种细胞、因子介入的复杂经过。PDGF、TGF、FGF等因子可通太多途径调控修复经过,促进伤口愈合。PDGF是第一个批准临床用于治疗皮肤损伤的细胞因子,Nagai等、Man-dracchia等用Becaplermin(重组人PDGF)治疗糖尿病患者的皮肤溃疡,发现Becaplermin可促进细胞的迁移、增殖,促进细胞因子的产生,促进伤口愈合。在证实鱼鳞胶原蛋白可促进成纤维细胞增殖、促进小鼠皮肤伤口愈合基础上,观察胶原蛋白对PDGF、TGFmRNA表示出及蛋白合成的影响。RealtimePCR检测结果表示清楚:胶原蛋白1mg治疗剂量在治疗早期,第5天即可促进PDGF、TGFmRNA表示出,表示出量分别为模型组的1.52倍、1.34倍。治疗第10天,表示出量已接近正常组。ELISA检测结果进一步证实:胶原蛋白可促进伤口处PDGF、TGF蛋白合成。因而,鱼鳞胶原蛋白可通过促进伤口处PDGF、TGFmRNA表示出及蛋白合成,促进伤口愈合。巨噬细胞在组织损伤修复中发挥重要作用。巨噬细胞功能具有可塑性及多样性,随微环境变化发生极化进而表现出不同的巨噬细胞亚型。M2型巨噬细胞可大量分泌