基因工程重组体转入受体细胞

基因工程重组体转入受体细胞第五章重组体导入受体细胞第一节重组体导入细菌细胞第二节重组DNA导入真核细胞2021/4/272第一节重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备二、重组DNA导入大肠杆菌2021/4/2731.目的增加受体菌细胞膜的通透性。一、感受态大肠杆菌的制备第一节重组体导入细菌细胞2021/4/274使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.菌种2021/4/2752021/4/276用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理2021/4/2774.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬2021/4/278二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)（3）转染（transfection)1.外源DNA导入细菌的几种方法（2）转导（transduction)2021/4/279转化：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。转化(transformation)2021/4/2710转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用转导(transduction)2021/4/2711转染(transfection)转染是转化的一种特殊形式。由transformation（转化）和infection（感染）两词构成。原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫转染。2021/4/2712例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。转化（transformation)2021/4/2713λ噬菌体的生活史例转导（transduction)2021/4/2714每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/gDNA）。（2）电转化法2021/4/271510ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法2021/4/2716LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L电转仪调为2.5kV,25F脉冲控制器200-4000.5g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法2021/4/27174.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜2021/4/2718环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒5.影响转化率的因素2021/4/2719目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连2021/4/2720①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜增加通透性。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞（competentcells)2021/4/2721把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（invitropackaging）2021/4/2722cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。（2）cI857基因突变的噬菌体2021/4/2723噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。（3）互补型噬菌体外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。噬菌体22021/4/2724E基因突变只合成尾部蛋白和包装识别蛋白D基因突变合成头部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包装DNA提取尾部蛋白提取头部和尾部蛋白重组的载体DNA体外包装成活性噬菌体2021/4/2725(4)体外包装过程2021/4/2726体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（5）转导2021/4/27272021/4/2728第二节外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞二、导入植物细胞三、导入哺乳动物细胞2021/4/2729转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第二节外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his312021/4/2730（1）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母载体PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。转化2021/4/2731

酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态40%PEG（聚乙二醇）（2）利用Li+盐进行转化2021/4/2732叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入植物细胞1.叶盘法（leafdisk)2021/4/2733植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25F电击愈伤组织幼苗分化2.电击法（electroporation)2021/4/2734又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m钨弹头吸附特制手枪射击植物装入3.基因枪法（genegun）2021/4/2735基因枪2021/4/2736（1）原理：三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。2021/4/2737不需要载体。