第41章基因工程及蛋白质工程12

第41章基因工程及蛋白质工程Chapter41.GeneandProteinEngineering1第一节概述基因工程（geneengineering）:是对携带遗传信息的分子进行施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。基因工程这个术语既可用来表示特定的基因施工项目，也可泛指它所涉及的技术体系，其核心是构建重组体DNA的技术，因此基因工程和重组体DNA技术(DNArecombination)有时也就成为同义词。

蛋白质工程（proteinengineering):是在基因工程基础上发展起来的。是指通过对蛋白质已知结构与功能的认识，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术改造蛋白质，以达到改进其某些性能的目的。21972年美国斯坦福大学的Berg和他的同事将λ噬菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入猴病毒SV40DNA中，首次构建出DNA的重组体。1973年，Cohen和Boyer获得了抗四环素和新霉素的重组菌落，标志着基因工程的诞生。EcoRIDNALigaseTetracyclinepSC101Kanamycin

R6-5KanrandTetr3

技术上的三大发现

限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）。载体的使用。逆转录酶的发现。4

第二节工具酶

DNA分子的剪切、重组、合成及修饰涉及一系列酶促反应，催化这些反应的酶是基因操作的基本工具，故又称为工具酶。工具酶在基因克隆中占有非常重要的地位，只有了解其作用机制后，才能加以灵活应用。5

用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶反转录酶6一、限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)又称限制性内切酶，简称为限制酶。这类酶能识别双链DNA分子内部的特异位点并且裂解磷酸二酯链。主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII。7（一)限制酶的命名和分类1.限制性核酸内切酶的命名属名种名株名Haemophilus

influenzae

d

（嗜血流感杆菌d株）HindII

HindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶82.限制性核酸内切酶的分类主要特性I型II型

III型蛋白结构限制修饰辅助因子识别序列切割位点双功能异源三聚体ATPMg2+SAMTGAN8TGCT（EcoB）AACN6GTGC（EcoC）距识别序列1kb处随机性切割单功能同源二聚体Mg2+旋转对称序列

识别序列内或附近特异性切割双功能异源二聚体ATPMg2+SAMGAGCCCAGCAG距识别序列下游24-26bp处9（二)II型限制酶的识别和切割位点II型限制性核酸内切酶的基本特性:识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列,大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构(palindrome).EcoRI的切割位点EcoRI的识别序列5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’10中英联合实验室EcoRI等产生的5‘粘性末端(Stickyend)退火4-7℃3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’POH5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’HOPEcoRI37℃3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’11PstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’POHHOP12PvuII等产生的平头末端(blundend)5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’13

现巳提纯供商品用的限制酶有400余种，其中常用者列举于表下表14

使用限制酶时应注意提供适宜的反应条件，如DNA底物的纯度、浓度、分子结构和构型、缓冲液的PH及离子强度等。如果反应体系不能满足最适条件，则可能导致酶产生第二活性，又称星活性(staractivity)，即限制酶严格的识别特异性降低，导致其在DNA分子内产生附加切割。如EcoRI，当反应条件改变时，其特异性可由原来6bp的GAATTC降为4bp的AATT，一般用EcoRI＊表示，称为EcoRI的星活性。15

由不同微生物分离得到的限制酶，如果识别位点和切割位点完全一样，称为同裂酶（isoschizomers）；如仅仅是粘性末端突出的单链相同，称为同尾酶（isocaudamers）。由同尾酶切割的限制片段彼此相连，不能再被原来的限制酶切割。例如，BamHI限制片段与BglII的限制片段相连后，其序列变为，与原来两个限制酶的识别序列均不相同，因此不再为原来的酶所切割。同裂酶、同尾酶16同裂酶GCCTAGGATCTA5'-3'--3'-5'GCCTAGGATCCGGATCCTAG5'-3'--3'-5'BamHI

BglII5'-A3'-TT-3'A-5'同尾酶17二.DNA连接酶

DNA连接酶(DNALigase)的作用是催化DNA片段之间的5’磷酸基和3’羧基间形成3’，5’-磷酸二酯键，主要用于连接两个独立的DNA片段或修复双链DNA中一条链上的切口。现常用的有：

T4DNA连接酶：粘性末端、平头末端，需ATP

大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端，需NAD+。18OHPOHP修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA连接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’19连接多个平头双链DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA连接酶5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’20三、DNA聚合酶

基因克隆中常用的DNA聚合酶(DNApolymerase)：大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）K1enow片段T4DNA聚合酶。1.大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）

大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质：5‘→3‘的DNA聚合酶活性

5‘→3‘的核酸外切酶活性

3‘→5‘的核酸外切酶活性

21由于它具有5’→3’核酸外切酶活性，当用缺口平移法(nicktranslation)标记DNA探针时，常用DNA聚合酶I。DNApolIMg2+5‘dNTP5‘pppdA（a-32P-dATP）DNaseI5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

222.大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）

Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶。Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。23Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列24Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’25Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记Klenowa-32P-pppdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’263.T4-DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位27T4-DNA聚合酶的基本用途I：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多28T4-DNA聚合酶的基本用途II：DNA片段的同位素末端标记5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApol5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolMg2+5‘pppdN5‘ppp

dA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T

3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘29四、反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶，AMV、M-MuLV）反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA反转录酶Mg2+dNTP303’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’5’

DNA3’反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链反转录酶反转录酶31大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）五、核酸酶ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’32ExoVII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3‘-OH端外切，并且优先切3‘凹陷端。双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）33lExo3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’双链核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）l核酸外切酶特异性地从5‘端外切34单链核酸内切酶：S1核酸酶来自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或

RNA（双链中的单链区）35DNAmRNA杂交S1EcoRIS1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）36Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）37EcoRIACEcoRIEcoRIBCABal31BCA环化ACBal31核酸酶的基本用途：诱发DNA缺失突变B38TdTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAOH3‘p5‘六、核酸修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）来自小牛胸腺5‘p3‘HOOH3‘p5‘不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs395‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘AAAAAAAAAAA405‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HOdN5‘HON碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）415‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5‘p3‘HOOH3‘p5‘T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷用于探针的末端同位素标记：42第三节载体

用来插人外源DNA片段构建重组DNA分子，并能将外源DNA携带进入宿主细胞的DNA称作基因克隆裁体，简称为载体(vector)。载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件43载体应具备的条件具有自主复制的能力

携带易于筛选的选择标记含有多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因插入除保留必要序列外，载体应尽可能小，便于导入细胞和进行繁殖使用安全

44一、质粒载体1.质粒的基本特征质粒（plasmid)是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是DNA型的绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA.质粒DNA的分子量范围：1～300kb45

拷贝数的控制机制-保持恒定的拷贝数

野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因物质抗性:抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物

物质合成:抗生素、细菌毒素、有机碱

这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义462.常用的质粒载体pBR322：①分子量较小，4.3kb，能克隆较大外源DNA；②具有氨苄青霉素和四环素两种抗生素的抗性基因；③在两种抗生素抗性基因中间存在限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选④具有较高的拷贝数，这为重组DNA的制备提供了极大方便。47pUC18/19：

pUC质粒载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5’端带有一段多克隆位点的1acZ’基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。①来自于pBR322质粒的复制起始点(ori)；②氨苄青霉素抗性基因(Ampr)；③大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因1acZ’的启动子及其编码。a-肽链的DNA序列；④位于lacz’基因中的靠近5’端的一段多克隆位点(MCS)区段；48PlaclacZ’MCSawX-galpUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷b-半乳糖苷酶的a-肽段49二、噬菌体载体1.大肠杆菌的l噬菌体（lphage)l噬菌体是一种大肠杆菌噬菌体，由头、尾两部分组成。头部呈六角型，装载了噬菌体的整个基因组(即lDNA)。lDNA为双链线状分子，长约48.5kb，在分子两端各有12bp的互补单链(是天然的粘性末端)，称cos位点。当噬菌体吸附于宿主细胞膜后，lDNA自噬菌体的尾部注入宿主细胞，其两个粘性末端互相结合，既可以裂解性生长，也可以溶解性生长。DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态502.l噬菌体载体

野生型l-DNA包装的包装范围为原来DNA的75-105%，即36-51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，野生型噬菌体经突变和缺失等手段改造，已衍生出上百种克隆载体。

衍生载体有插入型载体和置换型载体。

A．插入型载体

将野生型l噬菌体的lDNA中多余限制酶切位点删除，使其中心仅留有几个单一酶切位点。这样经限制酶切割的lDNA便能够与经同样限制酶消化的外源DNA片段结合，使之插入在这个位点上，而不导致噬茵体功能的丧失。51体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度

37kb插入片段大小：0-14kb插入型载体

当插入的cDNA阅读框与1acZ基因相一致时，能产生融合蛋白质，可以用免疫学方法，如蛋白质印迹分析进行检测。此外，因外源基因插入使1acZ基因失活，故在含x-gal培养基中形成白斑，而未重组的形成蓝色斑点，便于区分筛选。插入型载体有：Charon2、Charon6、lgt11等。52B.置换型载体

lDNA中心区段是一些非必需序列，将该区段删除并替换上一个两侧多克隆位点是反向重复序列的外源DNA片段，即可建成置换型克隆载体。当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段即会被置换掉，从而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。载体有：lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40等。插入片段最小装载长度

10kb载体长度

26kb插入片段最大装载长度

25kb体外包装体外包装533.M13噬菌体M13噬菌体的生物学特性：

生物结构M13噬菌体的外型呈丝状M13

噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成

M13

噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长

M13

DNA全长6407个核苷酸M13DNA上至少有10个基因2700个外壳蛋白分子54+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNA感染周期55

M13噬菌体的最大优点是噬菌体颗粒中所含的是单链DNA，可作为模版用于DNA序列分析。

另外，利用单链M13克隆可制备成单链DNA探针，用于检测DNA或RNA的杂交分析。

也可以用作基因定位诱变的载体。噬菌体成熟后分泌出细胞，可以从细胞培养液的上清液中获得噬菌体，制备单链噬菌体DNA。双链噬菌体DNA可通过裂解细胞进行制备。

但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb56pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI

考斯质粒（黏粒）是一类人工构建的含有l-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。1978年Collins和Hohn发明。1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段。装载范围为31-45kb。其本身分子较小，如pHC79仅6.4kb。由于非重组体质粒很小，不能在体外包装，因而体外包装的主要是重组体，有利于以后的筛选。4.考斯质粒（cosmid）57

三、表达载体

表达载体(expressionvector)是用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。这类载体除具有克隆载体所具备的性质外，还带有表达构件-转录和翻译所必需的DNA序列。表达载体包括原核细胞表达载体,真核细胞表达载体（昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物表达载体）。581.原核细胞表达载体-大肠杆菌表达载体

一个良好的大肠杆菌表达载体应具备克隆载体所具备的特性。选择标记的抗菌素抗性基因复制起始点克隆位点等此外，还应含有表达系统元件即启动子核糖体结合位点终止子59大肠杆菌表达载体的基本结构特征60

启动子trp一1ac启动子又称为tac启动子，是一个双启动子或称杂合启动子，由trp启动子加上1ac操纵子中的操纵基因、SD顺序融合而成。整个tac启动子受1ac阻抑物调控，在1ac阻抑物高水平表达的lacIq大肠杆菌菌株中，其转录可被抑制，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导其表达。

l噬菌体PL启动子是一种温度诱导的启动子，受控于温度敏感的阻抑物。在低温下(37℃)可以阻抑PL启动子的转录，但在高温下(42℃)则失去阻抑作用。含PL启动子的表达载体需转化到M5219茵株中才能调控表达。61

T7噬菌体启动子是一个表达效率很高的启动子，但需要特殊的受体菌，如JMl09(DE3)等。核糖体结合位点

mRNA在细菌中的翻译效率依赖于是否有核糖体结合位点(ribosomeBidingSite，RBS)的存在。RBS包括起始密码(ATG)和SD序列。SD(Shine-Dalgarno)序列,富含嘌呤核苷酸，16SrRNA3‘-末端富嘧啶的序列互补，mRNA于是与核糖体很好结合。

终止子

一个基因3’-末端的能被RNA聚合酶识别并停止转录的DNA序列称为转录终止子。原核生物终止子序列有一段富含A／T的区域和一段富含G／C的区域，富含G／C区域具有回文对称结构。这种终止子转录后形成的RNA具有茎环结构。622.真核细胞表达载体-哺乳动物表达载体

克隆基因要在哺乳动物细胞中进行表达，必须将基因重组到适当的真核表达载体中。哺乳动物表达载体含有必不可少的原核序列，如在大肠杆菌中能起作用的复制起始位点以及便于筛选重组质粒的抗生素抗性基因等，还含有在真核细胞中工作的遗传元件，如增强子、启动子、转录终止序列以及加多聚腺苷酸的信号序列等。63增强子一启动子

有些来源于动物病毒的启动子和增强子能被真核细胞识别。如SV40病毒早期基因增强子(SV40)、Rouse肉瘤病毒基因组长末端重复序列(Rsv)、人类原细胞病毒(heMV）等。转录终止和加poly(A)信号一是位点下游的GU富集区，二是Po1y(A)加尾信号：AAUAAA。64

第四节基因克隆的基本程序

基因克隆的基本程序包括五大步骤：①制备目的基因;②连接目的基因与裁体形成重组体;③将重组体转入宿主细胞；④重组体的筛选和鉴定；⑤重组体的扩增和表达。65目的基因是指要克隆或表达的基因目的基因可以有如下几种来源和制备方法：1．从基因文库中筛选：将某一种基因组DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G-文库(genomicDNAlibrary)。将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNAlibrary)。C-文库具有组织细胞特异性。

一、目的基因的制备66

基因组文库分离、纯化基因组DNA

条件：温和，在EDTA或SDS等存在下

↓RE

用蛋白酶K消化细胞、酚抽提大小不同酶切片段

片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离

↓分别与同样RE消化的载体连接

常用噬菌体载体或质粒载体

↓

DNA连接酶连接。

导入细胞

进入宿主细胞内培养扩增。

↓筛选鉴定

用分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定。67cDNA文库（1）合成cDNA第一条链反应体系只有mRNA、逆转录酶、4种dNTP、引物。引物是与mRNA3ˊ端polyA互补的寡聚dT（12～18dT片段）（2）合成cDNA第二条链

RNase去掉模板mRNA（3）构建cDNA文库①cDNA两端加接头②cDNA与载体相连。③导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存cDNA集合体便是cDNA文库。683.利用PCR合成：

如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。694.人工合成：

根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。

二、目的基因与载体重组

目的基因片段与适当的载体经限制酶剪切后，再在DNA连接酶的催化下即可相互连接，形成人工重组体。常用体外重组方法主要有以下四种。70粘性末端连接法：当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。71722.同聚物加尾连接法:当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3‘-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。733.人工接头连接法：

将人工接头（linker),即一段含有多种限制酶切点的DNA片段,连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。744.平端连接法：

利用T4DNA连接酶可催化连接相同或不同限制酶切割的平端dsDNA。75

在基因克隆技术中，将质粒DNA及其重组体导入细菌称为转化(transformation)；将病毒及其重组体导入宿主细胞称为转染(transfection)；将噬菌体及其重组体才入宿主细胞称为转导(transduction)。

三、重组DNA导入宿主细胞76

将受体菌悬浮在低温0℃和低渗CaCl2溶液中，菌菌体细胞壁通透性增加、膨胀成球形，易于吸收外源DNA，这种状态的菌称谓感受态菌（competant)。

1.氯化钙法77

电穿孔法（electroporation)最早用于DNA导入真核细胞，现已用于大肠杆菌和其他细菌。将对数生长期的大肠杆菌与外源DNA混合于电穿孔杯中，在高频电流作用下，细胞壁出现许多小孔，外源DNA即可进入细胞内。电转化应在0℃～4℃进行。该法的优点是无需制备感受态细胞，故操作较氯化钙法简单，其转化率也比较高，可获得108～109转化子／mgDNA。其缺点是需特殊仪器。2.电穿孔法78

近年相继发展了系列广谱和高效的脂质体。脂质体是一类双层的微囊结构，如DOSPER和infectAMINETM，含有一个亲水性正电荷的精胺基团头和疏水性脂酸尾，可与DNA分子结合成脂质体／多核苷酸复合物，使DNA免受DNase的降解，精胺基团可与带负电荷的细胞表面非特异吸附，易于通过细胞内吞作用而进入细胞内。该方法的优点是转化率最高，转化细胞类型广泛。其缺点是脂质体价格昂贵。3.脂质体转染法79

显微注射法是在显微镜下，经细胞玻璃针将外源DNA直接注入细胞。该方法是将DNA准确注入细胞核中最可靠的方法，特别是借助于电脑技术更为精确快速。该法适用于多种贴壁生长细胞及悬浮生长细胞.其缺点是仪器昂贵，对实验者的操作技巧和熟练程度的要求比较高。4.显微注射法80根瘤土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）的Ti质粒（tumer-inducingplasmid）有一段T-DNA，即转移DNA，能携带基因转移到植物细胞内并整合到染色体DNA中。因此Ti质粒是目前植物基因工程最常见的基因载体。将外源基因插入Ti质粒载体的T-DNA

，借助土壤杆菌而将外源基因导入植物细胞。

5.根瘤土壤杆菌法81

基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。6.基因枪法82四、重组体的筛选和鉴定

由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行：

1.根据重组体的表型进行筛选：对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。还可以根据b-乳糖苷酶a-互补(alphacomplemention)的颜色反应进行筛选。83842.根据标志互补进行筛选：

当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体853.根据DNA限制酶谱进行分析：

经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。864.用核酸杂交法进行分析鉴定：为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。875.PCR筛选法:一些载体克隆位点外源DNA插入点两侧存在可作为PCR引物的已知序列，如pGEM载体系列的多克隆位点(MCS)两侧为SP6、T7，对抽提出的重组DNA进行PCR分析，不但可迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA序列测定。6.免疫化学等方法:如果外源基因能够在宿主细胞进行表达，合成外源蛋白质．可以采用免疫化学等方法检测，即用已知的抗体来检测目的基因编码的抗原。88第五节真核基因在大肠杆菌中的表达根据被表达的基因和表达基因所用的系统可将表达分为四种：①原核基因在原核细胞中的表达；②真核基因在原核细胞中表达；③原核基因在真核细胞中表达；④真核基因在真核细胞中表达。89一、真核基因在大肠杆菌中表达的基本条件

①真核细胞的目的基因必须来自于cDNA；

②真核基因mRNA缺乏结合细菌核糖体的SD序列，因此

cDNA的起始密码子(ATG)上游部分(5’端非编码区)是无用的，必须除去;③表达载体应是含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子如PL、tac、T7等;④为提高表达效率，应根据启动子类型和特定的蛋白质，选择合适的菌株和诱导条件。90二、真核基因在大肠杆菌中的表达方式真核基因在E.coli中可以表达为:融合蛋白、非融合蛋白或分泌型表达。1.融合蛋白融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。融合蛋白中由于含有一段原核多肽序列。缺点：可能影响其真核蛋白的免疫原性；优点：①在菌体内比较稳定，容易实现高效表达；②基因操作比较简单；③可以切除其氨基端的原核多肽，而获得具有生物学活性的真核天然蛋白分子。91

非融合蛋白是指在细菌内表达的蛋白。以真核蛋白mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含任何原核多肽序列。为此，表达非融合蛋白的操纵子须改建成原核启动子—原核SD序列—真核基因的起始密码子、结构基因及终止密码子。3.蛋白分泌型表达

将真核基因重组于编码原核蛋白信号肽序列的下游，以表达带有原核蛋白信号肽的融合蛋白。这种融合蛋白当分泌到位于E.coli细胞内膜与外模之间的间质时，其信号肽可被信号肽酶切割，而真核蛋白分泌至胞外。2.非融合蛋白92优点：①可减少所需蛋白质在宿主菌内的降解；②有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌表达时则具有活性；③分泌后的蛋白质氨基端不含起始密码子编码的甲硫氨酸；④蛋白质分泌至胞外后便于提纯。93第六节、蛋白质工程94一.蛋白质工程的理论和技术基础蛋白质结构和功能的关系DNA重组技术和基因定点诱变等技术二.蛋白质工程的研究内容通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效及独立工作的能力；通过改变蛋白质的结构顺序，提高其在极端条件(如酸、碱、热等)下的稳定性；通过改变蛋白质的结构顺序使其便于分离纯化。95三.蛋白质工程的目的1)研究蛋白质结构与功能的关系2)改变蛋白质的特性3)生产蛋白质和多肽类活性物质提高酶的产量和创建新型酶设计和研制新型抗体设计和研制多肽及蛋白质类药物设计合成全新蛋白质96四、蛋白质工程的技术原理定点诱变(Site-directedMutagenesis)

蛋白质的结构决定功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。在体外对某个已知基因的特定碱基进行定点改变，通过取代、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构的技术叫定点诱变。对突变基因的表达产物进行研究不仅有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，还可以改造天然蛋白质的性质。97定点诱变的优点

传统的诱变技术（如化学或物理诱变剂）处理的生物体，具有突变频率低且任何基因都可能发生突变等问题。定点诱变技术是一种通过改变基因中的特定位置的碱基，从而改造蛋白质的技术。跟传统的诱变技术相比，具有高效、简单、目的性和重复性强等特点，是我们在实验室中改造、优化基因常用的手段。98带突变位点的寡核苷酸可介导定点诱变99Kunkel法Dut:dUTP酶Ung:N-尿嘧啶脱糖苷酶100PCR诱变法的步骤PCR诱变法的原理是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。

PCR定点诱变法可分为重组PCR定点诱变法和大引物诱变法两种。重组PCR定点诱变法：该方法是利用四种引物，三轮PCR反应来进行的,操作较为繁琐。大引物诱变法：该方法是利用三种引物，两轮PCR反应来进行的。101重组PCR定点诱变法102大引物PCR定点诱变法(分离扩增产物)103盒式诱变(cassettemutagenesis)104

利用定点诱变的方法对天然酶蛋白质进行改造已有很多成功的例子。然而，该方法仅适用于三维结构以及结构与功能的相互关系基本清楚的蛋白质，目前我们对这类关系的认识还很肤浅。对于那些结构与功能关系尚不清楚的酶蛋白，定点突变是无能为力的。近年来有人提出“定向进化”的观点，为酶的结构与功能的研究开辟了崭新的途径。105

酶(蛋白质）的体外定向进化(directedevolutionofenzymeinvitro)是1993年,由美国科学家Aronld首先提出的概念，是改造酶蛋白质分子的一种新策略。它不需事先了解酶的定向结构和催化机制，在实验室模拟自然进化机制，通过由易错PCR、致突变菌株诱变等方法对编码酶蛋白质的基因进行随机诱变，由DNA改组(DNAshuffling)、随机引发重组和交错延伸等方法进行突变基因体外重组，设计高通量筛选方法来选出需要的突变株。不仅可快速生产工业上有用的新酶，而且为研究蛋白质的结构与功能的关系开辟了崭新的途径。2.定向进化106107定向进化的常用技术易错PCRDNA改组随机引发重组交错延伸技术108易错PCR易错PCR（errorpronePCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。连续易错PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。109DNA改组

DNA改组(DNAshuffling)是Stemmer于1994年建立的模仿自然进化的一种DNA体外随机突变方法。所谓DNA改组，就是将DNA拆散后重排，即将一种基因或具有结构同源型的几种基因在DNaseI的作用下随机酶切成小片段，这些小片段之间有部分的碱基序列重叠，它们通过自身引导PCR(self-primingPCR)延伸，并重新组装成全长的基因，这一过程被称为再组装PCR(reassemblyPCR)。110DNA改组的基本过程目的基因的准备：根据需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因；DNaseI酶切：将目的基因随机切割成约10-50bp或300bp左右的小片段；不加引物的PCR：在Taq酶的作用下将DNaseI切割后的DNA重叠小片段重新连接起来，在此过程中可能发生许多突变和重组加入引物的PCR：加入目的基因片段两端的引物，使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。得到正突变子又可以重复进行改组，使性状进一步提高。111112随机引发重组

随机引发重组(random-primingrecombination，RPR)是Aronld于1998年首先报道。其基本原理是以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的DNA小片段，由于碱基的错误掺入和错误引发，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随重组，再组装成完整的基因，克隆到表达裁体上，随后筛选。113114第七节、基因工程与蛋白质工程的应用与展望

基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。

1151、基因工程技术与医药制造业

1982年,美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场,标志着世界上第一个基因工程药物诞生。目前,以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一,发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核苷酸药物等。116117胰岛素1000磅牛胰10克胰岛素200升发酵液10克胰岛素干扰素1200升人血1升发酵液2－3万美元/病人200－300美元/病人1182、基因工程技术在工业生产中的应用

随着石油、煤炭等不可再生资源的大量消耗，能源危机和环境污染已经成为影响人类可持续发展的最大障碍。以中国为例，按已探明储量和年开采量计算，中国的石油资源有可能在20余年内枯竭。面对日益增加的危机，大力开发新的可再生性资源已经成为人类走可持续发展道路的前提条件。生物质资源是地球上数量最丰富的可再生资源，全球每年光合作用的生物质高达1500-2000亿吨，其中80%以上为木质纤维素类物质，估计其年产量相当于目前所需能源的10倍，但这些可再生资源被作为能源利用的还不到1%。所以，开发利用生物质可再生资源是十分必要和迫切的。目前，利用生物质—如淀粉和纤维素等可再生资源转化生产燃料酒精已经成为研究的热点。119

但由于纤维素的组成和结构非常复杂，使得在纤维素的生物降解和纤维素水解产物的生物转化上，都还存在着一些问题，如：纤维素酶活力低、微生物对纤维素水解底物利用率低等。为此，人们尝试利用基因工程手段，对微生物进行定向改造来促进可再生资源的生物转化。

已经从细菌和真菌中克隆到各种纤维素酶基因。如人们已成功将来自粪肥纤维单胞菌的内切和外切纤维素酶基因导入酵母中，发现其能向培养基中分泌纤维素酶，且活性提高了70%。120

通过基因工程育种可使植株获得各种抗性，使品质和产量得到改良和提高3、基因工程技术在农业上的应用

1994年第1个转基因作物产品延熟保鲜转基因番茄获得美国农业部和美国食品与药品管理局批准进入市场,开创了转基因食品商业应用的先河。截止1998年6月，国外批准商业化生产的各类转基因作物已近90种，常用的有大米、玉米、棉花、油菜和马铃薯。1986年全世界被批准进入田间实验的植物只有5例，到1997年达2,584例。大量的转基因生物体作为食品或其他生活品进入人们的生活。121

我国人口众多，土地资源相对贫乏，粮食生产压力很大。GMO能改善食品品质、抗虫、增产、增加作物对病菌的抵抗力，减少水土流失及农药使用量，从而带来显著的农业效益和经济效益。

2008年7月9日,国务院常务会议就审议通过“转基因生物新品种培育科技重大专项”,该专项拟投入资金约240亿元人民币,将主要投入到优势基因的挖掘、转基因品种选育和转基因作物品种的产业化;其次,2009年中央一号文件中曾提到,我国将加快推进转基因生物新品种培育科技重大专项,整合科研资源,加大研发力度,尽快培育一批抗病虫、抗逆、高产、优质、高效的转基因新品种,并促进产业化。

2009年12月，我国转基因玉米(中国农业科学院生物技术研究所)和转基因水稻(华中农业大学)获得安全证书.122转基因作物123124125126127苏云金杆菌在芽孢形成过程中，菌体内可产生大量具有高度特异性杀虫活性的结晶蛋白组成，这种蛋白通常被称之为杀虫晶体蛋白或苏云金杆菌毒蛋白（Bttoxin）。Bt基因是目前抗虫转基因中应用最为广泛和成熟的一种基因。Bt对于鳞翅目某些昆虫的幼虫有特异的毒性作用。128Non-transgenicsTransgenicsHerbicideResistancetransgene=modifiedEPSPsynthaseorphosphinothricin-N-acetyltransferase129改善营养品质的转基因植物TheGoldenRiceStory

VitaminAdeficiencyisamajorhealthproblem

Causesblindness

Influencesseverityofdiarrhea,measles

>100millionchildrensufferfromtheproblem

Formanycountries,theinfrastructuredoesn’texisttodelivervitamin