第一章 分子生物学的基本操作

第一章分子生物学的基本操作分子生物学研究从20世纪中叶开始高速发展的最主要原因——现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定点突变PCR扩增基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。技术保证1——DNA的核苷酸序列分析技术DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。1.1重组DNA操作的两大技术保证知识回顾——核酸的化学组成核酸（RNA、DNA）核苷酸磷酸核苷戊糖碱基核糖（RNA）脱氧核糖（DNA）A、G、C、UA、G、C、T戊糖碱

基腺嘌呤鸟嘌呤嘌呤嘧啶尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶核苷如果是存在于DNA中的脱氧核苷则2’位则是H而不是OH。磷酸+戊糖+碱基=核苷酸核苷酸的连接方式核苷酸之间以磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。技术保证2——DNA的体外切割和连接1962年Arber发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了DNA连接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。这就是基因克隆，或分子克隆。1.2细菌转化分子克隆的载体----具备自主复制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒DNA。1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。感受态细胞制备及细菌转化步骤：处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复。3.立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。2.Ca2+与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。5.涂布于选择性培养基中分离转化子。1.3基因扩增聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。基本原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由高温变性—低温退火—适温延伸三个基本反应步骤构成，经多个循环，理论上靶DNA分子将呈现指数性扩增。PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的互补

链。Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR仪1.4

核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。

基本原理

一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与分子同介质的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数，因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。大分子量的DNA移动的慢小分子量的DNA移动的快电泳缓冲液阳极阴极DNA加样孔琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间称样溶解加热制板倒胶电泳操作基本程序取样点样电泳检测结果检测:溴化乙锭（ethidiumbromide，简称EtBr）染色，紫外观察。在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。1.5

基因工程载体

1.至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。

2.

至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。

3.

至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞

4.安全性大肠杆菌载体pBR322结构图

载体特点基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携其进入适当宿主细胞且能自主复制的DNA分子。1.5.1

质粒DNA及其分离细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双链DNA组成的复制子，也有线性质粒的报道。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

E．coli的质粒种类

1)colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。

2)R因子（抗药性因子）

可接合转移DNA，属低拷贝严紧型，质粒较大，操作不便

3)F因子（性因子）质粒载体DNA的分离——碱裂解法碱裂解法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在pH大于12的碱性条件下染色体DNA的氢键断裂双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH恢复至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心染色体DNA与不稳定的大分子RNA蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。1.5.2

重要的大肠杆菌质粒载体1.5.2.1.

pSC101质粒载体pSC101是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1～2个拷贝。其分子大小为9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr）。

pSC101质粒不仅具有可插入外源DNA的多个限制性核酸内切酶的单克隆位点，而且还具有四环素抗性的强选择记号，因此，它被选为第一个真核基因的克隆载体。当然，这个质粒载体也有其明显的缺点，它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，其产量就要比其它质粒载体低得多。1.5.2.2.

ColE1质粒载体

ColE1质粒属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常生长条件下，当培养基中用于蛋白质合成的氨基酸被耗尽，或是在对数生长末期的细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。此时，松弛型复制控制的质粒DNA仍然可以继续进行复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积的ColE1质粒拷贝数增加到1000~3000个之多，质粒DNA大约可占细胞总DNA的50%左右。由此可见，由于质粒拷贝数高，插入的外源DNA片段的产量也就得到相应的提高。

1.5.2.3

pBR322质粒载体pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒、转座子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。123第一个优点：分子量较小，易于纯化，操作便利。第二个优点：具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。质粒DNA编码的抗生素抗性基因的插入失活效应，是检测重组体质粒的一种十分有用的方法。第三个优点：具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。pBR322质粒载体的优点思考题使用pBR322载体进行基因克隆易于造成载体自身连接环化,为什么?1.5.2.4

pUC质粒载体pUC系列质粒载体包括如下四个部分：(i)来自pBR322质粒的复制起点（ori）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制性核酸内切