一种测定葡萄糖的方法

一种测定葡萄糖的方法在烷基糖昔合成过程中，应用DNS为显色剂的分光光度法对烷基糖昔合成过程中葡萄糖的分析测定进行了研究。研究结果表明：采用玻璃比色皿，在最大吸光度为510nm波长，葡萄糖浓度范围为1.6-40.9ug・mL-i,吸光度与葡萄糖浓度满足线性关系具有良好的线性关系，吸光度与葡萄糖浓度标准曲线为A=0.0109c,摩尔吸光系数为1962mol-i・L・cm-i，相关系数为0.9992，回收率在97%-103%之间，显色体系中含有脂肪醇及烷基糖昔对体系吸光度没有影响。DNS显色分光光度法用于烷基糖昔水解体系还原糖含量的测定可行，该方法方便快捷、准确度高。化学分析法是应用葡萄糖分子结构中含有醛基的特点进行分析测定，一般是采用裴林试剂测还原糖的方法，葡萄糖具有还原性，可用还原糖法的测定方法测定，但是还原糖法特异性较差，如果样品中混有其他还原糖可使结果偏高。优点是方法简单、实用，缺点是通常适用于高浓度系统，但是体系中混有溶剂时，此方法观察终点不明显。分光光度法测定葡萄糖分为蔥酮显色法和DNS显色法，但是由于蔥酮显色法实在酸性体系中显色，而酸性体系烷基糖昔存在水解副反应的发生，影响测定结果，也不能用于烷基糖昔合成体系中的葡萄糖测定［5,6］。而分光光度法中采用DNS显色法在碱性体系中显色，烷基糖昔在碱性体系中稳定，是合适的分析测定方法。为了获得控制萄糖直接与高碳脂肪醇进行缩合反应生成烷基糖昔反应过程中葡萄糖的浓度，采用斐林试剂滴定，由于由N-甲基毗咯烷酮的存在，测定突变点无法确定。探讨了显色剂用量、显色时间、显色体系碱浓度对吸光度的影响，考察了测定系统中脂肪醇、烷基糖昔存在对测定经过的干扰情况。为改善萄糖与高碳脂肪醇进行缩合反应过程，提高合成烷基糖昔反应过程的速度、进一步提高烷基糖昔产品的质量，也为研发葡萄糖颗粒与脂肪醇的新工艺技术提供分析测定的可靠方法。葡萄糖具有醛基，具有还原性，碱性条件下可将3,5-二硝基水杨酸还原为3-氨基-5-硝基水杨酸，而3-氨基-5-硝基水杨酸在碱性条件下成橘红色，在一定的实验条件下具有最大吸收，并且在一定葡萄糖浓度范围内与其最大吸收波长下的吸光度成线性关系，本质为3-氨基-5-硝基水杨酸浓度与其最大吸收波长下的吸光度成线性关系，通过吸光度与3-氨基-5-硝基水杨酸浓度线性关系以及葡萄糖浓度与产物3-氨基-5-硝基水杨酸浓度反应关系的线性建立联系，从而以葡萄糖浓度和吸光度做标准曲线，通过测定样品吸光度对应算出样品中葡萄糖浓度，此外，配方中其他成分主要是去除试剂中的游离氧和增强并稳定显色效果［⑶。利用各种糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。对非还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成还原性单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(常以葡萄糖含量计)。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类。单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，例如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以系数0.9。DNS显色剂配制称取6.5g的DNS溶解于加热至约50°C的300mL水中，移入lOOOmL的容量瓶中，再称取24.1g氢氧化钠溶解于水300mL水中配制成2mol•L-1氢氧化钠溶液移lOOOmL容量瓶中，之后加入丙三醇46.1g，振荡均匀，待溶液冷却后定容并振荡均匀，即得DNS试剂(28.5mmol.L-1),贮于棕色试剂瓶中避光保存备用。葡萄糖标准溶液配制称取一水葡萄糖1.1361g加适量水溶解后移入1000mL的容量瓶中，定容后振荡均匀成为1.0225mg.mL-1的葡萄糖标液(5.7mmol・L-1)。贮于试剂瓶中贴标签备用。标准曲线的绘制及葡萄糖回收率的测定用逐级稀释方法配制不同浓度的葡萄糖溶液，分别移取2mL上述溶液于试管中，并移入氢氧化钠溶液和显色剂，经显色反应数分钟后静置一段时间，后移入50mL容量瓶中定容，测定其紫外可见光谱，以吸光度A对浓度作图即得葡萄糖的标准曲线。配制不同浓度的葡萄溶液使葡萄糖浓度范围在所做标准曲线线性范围内，分别移取2mL上述溶液于试管中，并移入氢氧化钠溶液和显色剂，经显色反应数分钟后静置一段时间，后移入50mL容量瓶中定容，测定其紫外可见光谱得到吸光度，通过葡萄糖的标准曲线得到相应葡萄糖浓度，即得到葡萄糖的回收率。图1为DNS（蒸馏水为参比）的紫外可见吸收光谱，图2为消除DNS试剂吸光度影响后不同浓度葡萄糖c对应显色产物的紫外可见吸收光谱。0.0350400 450 500Wavelength/nm0864210.0350400 450 500Wavelength/nm086421aaaaecnaDrosDA300图1DNS的紫外可见吸收光谱Fig.1TheUVandVisspectraoftheDNS

ecnaDrosb0.000.05480 500 520 540 560 580Wavelength/nm5■2ecnaDrosb0.000.05480 500 520 540 560 580Wavelength/nm5■25Oaa600图2消除DNS吸光度影响后不同浓度葡萄糖对应显色产物的紫外可见光谱Fig.2TheUVandVisspectraofthechromogenicproduct

c/“g・mL-l：—28.6；—.—20.4；—▲—12.2；—4.0由图1试剂DNS的紫外吸收光谱可知，在波长为370nm处出最大吸收波长。最大吸收波长370nm为DNS的最大吸收波长。除此之外，DNS本身为黄色，在可见光区有吸收，但是未出现最大吸收波长。由图2可知，在500nm左右小范围内不同葡萄糖浓度显色溶液谱图均出现了最大吸收波长，此处离DNS的最大吸收波长370nm较远，因此受DNS吸光度影响较小，考虑到最大吸收波长较小范围的红移或蓝移，故选取波长510nm为氨基化合物的最大吸收波长。显色剂的用量图3为最大吸收波长510nm处DNS与葡萄糖摩尔比对显色体系吸光度的影响曲线。1.80.40.21.80.40.2_ecnaDrospA,i ,i ,i ,i ,i ,i ,0.00 1 2 3 4 5 6 7Moleratio图3DNS与葡萄糖摩尔比对显色体系吸光度的影响曲线Fig.3TheeffectofthemoleratioofDNSandglucoseonthechromogenicsystemofabsorbance由图3可知，随着显色剂DNS量的不断增加，氨基化合物的在最大吸收波长510nm处的吸光度不断增加并趋向平稳，这是由于随着DNS量的增加葡萄糖不断反应最终完全反应，显色产物氨基化合物的吸光度随之不再变化，即DNS与葡萄糖摩尔比为4：1后，氨基化合物的吸光度基本不发生变化，因此DNS显色分光光度计定量测定葡萄糖的DNS与葡萄糖摩尔不低于4：1,为了提高实验的准确性，本实验中均移取DNS试剂2mL，显色体系中DNS与葡萄糖摩尔不低于4：1，确保显色体系中葡萄糖完全反应。显色反应时间的选择图4为最大吸收波长510nm处显色反应时间对显色体系吸光度的影响曲线。ecnaDrosDA00n・1tecnaDrosDA00n・1t图4显色反应时间对显色体系吸光度的影响曲线Fig.4Theeffectofthechromogenictimeonthechromogenicsystemofabsorbance由图4可知，葡萄糖与DNS试剂在沸水浴条件下反应很快，在沸水浴显色反应9min后，最大吸收波长处的吸光度不再发生变化，这是由于在DNS与葡萄糖反应已经充分，生成的显色产物的量也不再发生变化，为确保葡萄糖反应完全,因此可取沸水浴显色反应时间为9min。碱液浓度的选择图5为最大吸收波长510nm显色反应过程中不同碱液浓度勺对显色体系吸光度的影响曲线。0.905■8ecnaDrospA757060

a2030CmmLO•4g70800.905■8ecnaDrospA757060

a2030CmmLO•4g7080图5不同碱液浓度对显色体系吸光度的影响曲线Fig.5Theeffectofthelyeconcentrationonthechromogenicsystemofabsorbance由图5可知，葡萄糖与DNS试剂在沸水浴条件反应过程中，随着碱液量的增加，吸收波长510nm处的吸光度不断增大，并在氢氧化钠浓度为23mg/mL后达到平衡，随后随着氢氧化钠浓度的增加，吸光度不再发生变化，即在一定氢氧化钠浓度范围内体系碱溶液浓度对反应有影响，而碱溶液达到一定浓度后对吸光度没有影响。这是由于显色反应是在碱性条件下可将3,5-二硝基水杨酸还原为3-氨基-5-硝基水杨酸，碱液浓度不足葡萄糖难以反应完全。因此显色反应过程中氢氧化钠浓度应不低于23mg/m1，在本实验中显色反应均加入ImL的4mol・L-i，确保葡萄糖完全参与反应。显色反应后光照对显色溶液吸光度的影响图6为两种葡萄糖浓度（36.8》g・mL-1和40.0pg・mL-i）分别在光照和避光条件下不同波长出显色溶液吸光度随时间的变化关系图。0.8ecnaDrospA2030405060n・10.8ecnaDrospA2030405060n・1m图6显色体系吸光度随时间变化关系图Fig.6Thediagramofchromogenicsystemabsorbancechangewithtime-.-40.0pg/ml,光照，470nm；-40.0pg/ml,光照，510nm；-36.8pg/ml,避光，510nm.；-36.8pg/ml,避光，470nm由图6可知，葡萄糖与DNS试剂在显色反应后所得的显色溶液，在光照条件下，吸收波长510nm处的吸光度基本保持不变，此波段主要受显色产物吸光度的影响，可见显色产物吸光度不受光照影响。在光照条件下，吸收波长470nm处随着时间的延长吸光度明显减少，这是由于在DNS对光照敏感，而在此处DNS影响仍然存在。此外，在避光条件下，在吸收波长为470nm和510nm处，吸光度均没有明显的变化，即在避光条件下，放置时间对显色后溶液的吸光度没有影响。因此，在定量测定葡萄糖时，显色反应后的溶液最好立刻进行光度测定，若不能及时测量，则要避光保存，以确保定量的准确性。显色反应过程中烷基糖苷量对显色溶液吸光度的影响表1为在体系中加入不同量的一定浓度烷基糖苷后经显色反应,510nm处不同烷基糖苷量VA对应体系吸光度。表1不同烷基糖苷量下显色溶液的吸光度Table1.TheabsorbanceofchromogenicsolutionindifferentalkylglucosidequantityVA/mL0.51.01.52.02.53.0A0.7170.7190.7130.7160.7120.714由表1可知，葡萄糖与DNS试剂在显色反应过程中，随着烷基糖苷量的增加，吸收波长510nm处的吸光度基本保持不变，这是由于烷基糖苷在碱性溶液中化学稳定性和热稳定性都非常好，不会因分解产生葡萄糖而影响最大吸收波长处的吸光度，并且烷基糖苷在可见光区没有吸收，而在紫外区吸收很弱，因此DNS显色分光光度计可用于含有烷基糖苷体系的还原糖的定量测定。显色反应过程中癸醇量对显色溶液的影响表2为在体系中加入不同量的饱和癸醇水溶液后经显色反应,510nm处不同癸醇量VD对应显色溶液吸光度。表2不同癸醇量下显色溶液的吸光度Table2.TheabsorbanceofchromogenicsolutionindifferentalcoholdecanolquantityVD/mL01.02.03.04.05.0A0.6980.6950.6940.6970.6930.696由表2可知，葡萄糖与DNS试剂在沸水浴条件反应过程中，随着癸醇饱和水溶液量的增加，最大吸收波长510nm处的吸光度基本保持不变，这是由于癸醇此过程中不参加反应，同时体系为均相，并且癸醇在可见光区没有吸收，而在紫外区吸收很弱，因此DNS显色分光光度计可用于含有脂肪醇体系的还原糖的定量测定，但是要确保在测定过程中稀释后脂肪醇完全溶解。标准曲线的绘制标准曲线选取了500nm、510nm、530nm、550nm四个波长进行对比选择。表3为对不同波长处的标准曲线进行线性拟合所得的参数，图7为以510nm波长处为例进行的线性拟合图。

ecnaDrosDA表3不同波长处对应线性拟合参数ecnaDrosDATable3.ThelinearfittingparametersofdifferentwavelengthsA/nm斜率B摩尔吸mol-1・L・cm-1光系；数i相关系数R标准偏差SD5000.010919620.99760.01205100.010218360.99920.00645300.007413320.99940.00405500.00407200.99930.00240.00 10 20 30 40 50c/|jg・mL-1图7吸光度与葡萄糖浓度标准曲线Fig.7ThecurvesofabsorbanceAversusconcentrationcofglucose由表3可知，在四个波长下的葡萄糖浓度和对应吸光度在葡萄糖浓度范围为1.6-40.9》g・mL-i内线性相关性均良好，其中吸收波长510nm和530nm处的线性相关性最好，如图7,最大吸收波长500nm处的线性相关性比波长510nm和530nm处小的原因在于体系最大吸收波长的红移或蓝移的影响，而在波长510nm处此影响已相对减弱。可见DNS显色分光光度计用烷基糖苷体系中测定还原糖在较大的波长范围应用标准曲线法都有较好的线性相关性。标准曲线法测定还原糖的回收率标准曲线法测定回收率同样选取了500nm、510nm、530nm、550nm四个波长进行对比选择。表4为不同波长不同葡萄糖浓度下对应的显色溶液吸光度及计算所得回收率。表4不同波长处回收率Table4.Therecoverypercentofdifferentwaveleng