第三章 层析技术

第三章层析技术Chromatography作者：王英联系电话、概述

层析（Chromatography）又称为色谱,它利用混合物中各组分的物理、化学性质间的差异(溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附力、分子亲和力等)，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。

1、分配系数(Partitionchromatography)

混合物在层析过程中不管层析技术采用的流动相和固定相是哪种状态都要达到分配平衡。叙述一种物质在两种特定的相中的分配程度用分配系数（K）来表示。在特定温度时这个系数是一个常数。 溶质在固定相中的浓度 Cs

K=———————————=——

溶质在流动相中的浓度Cm

从一个混合物中分离、纯化样品的纯度如何，取决于混合物中各组分K值的差异程度。

混合物中各组分若K值相差较大,则较易把混合物中的各样品分离。反之,K值相差较小,则不易分离。2、塔板理论在层析分析过程把层析柱划分(想象)为若干个连续部分,每个部分称为一个塔板。理论板数(n)：在层析柱上，溶剂连续不断加入，化合物在流动相和固定相中不断分配平衡，所发生的平衡次数称为理论板数。色谱历史古罗马人分析混合染料（类似辐射纸色谱）1903年，MichaelTswett提出色谱法1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素1941年，Martin和Synge提出分配色谱法1944年，Martin等又提出纸色谱法1952年，Martin和James发明了气液色谱法1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC)1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱(high-performanceliquidchromatography,HPLC)仪1975年，Small等提出离子色谱

20世纪80年代，超临界色谱20世纪90年代，毛细管电泳（1809年Reŭss第一次电泳实验）21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更大的发展

层析法进行时有两个相组成，一个为固定相(Stationaryphase)，另一个为流动相(Mobilephase)。由于各组分所受的在固定相的阻力和流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得到分离。二、层析的一般原理三、层析技术的分类

(一)按两相所处的物态分类以液体作为流动相的称为液相层析以气体作为流动相的称为气相层析其固定相也可有两种状态:以固体作为吸附剂的固定相以涂布在固体表面的液体作为固定相（二）按固定相形式分类1、柱层析（columchromatography）将固定相装在层析柱中2、纸层析（paperchrmatography）纸作为固定相3、薄层层析（thinlayperchromatography）将吸附剂在玻璃板或其他材料薄板上铺成薄层作为固定相（三）按层析过程的机制可分类

1、吸附层析(adsorptionchromatography)利用不同组分吸附能力的不同进行分离2、分配层析(partitionchromatography)利用不同组分配系数不同进行分离3、离子交换层析（ion-exchangechromatography）

利用离子交换剂与各组分之间的静电力不同4、凝胶层析（gelchromatography）利用不同组分之间分子大小不同进行分离5、亲和层析（affinitychromatography）利用生物大分子之间特有亲和力的不同进行分离

第一节凝胶层析

GelChromatography

一、概念：凝胶层析：按照被分离物质分子大小,经过具有一定孔径的多孔凝胶物质进行分离的一种方法。又称为凝胶过滤或分子筛过滤或排阻层析。

主要机理是分子筛效应,当被分离物质流经凝胶柱时,因各组份的分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。将样品加入凝胶柱后,分子大的组份不能进入凝胶中被排阻在外,而分子的小能通过孔隙进入凝胶中。加入洗脱剂后,大分子就随洗脱剂从凝胶颗粒间隙洗脱下来,其流程短流速快,而小分子物质从上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中,这样多次反复即流程长,故大分子物质先从柱中流出,小分子物质后流出而得到分离。二、基本原理

大分子不能进入凝胶孔隙中,被排阻在外,受到阻力小,流程短，流速快，先从柱中流出。

小分子进入凝胶孔隙中,阻力大，流程长，流速慢，后从中柱流出

。

三、凝胶层析的数理关系

1、柱床体积(VT)：即凝胶颗粒的体积以及外部间隙体积的总和。2、洗脱体积（Ve）：即欲分离物质被洗脱下来所需的洗脱液的体积。3、外水体积（V0）：即凝胶颗粒间隙水的体积，相应于流动相的体积。4、内水体积（Ｖｉ）：即凝胶颗粒内所含水的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量求得。5、凝胶颗粒干体积（Ｖｇ）ＶＴ＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ

洗脱体积（Ｖｅ）与Ｖｏ及Ｖｉ之间的关系

Ｖｅ＝Ｖｏ＋ＫｄＶｉＫｄ＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／Ｖｉ

Ｋｄ为分子量不同的样品组分在凝胶内部和外部两相间的分配系数。它与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关，而与柱的长短粗细等物理条件无关。

Kd=0时,Ve=Vo,意味着该分子完全被排阻于凝胶颗粒之外,在固定相分布为0,全部分布于流动相里而最先流出。当Kd=1时,Ve=Vo+Vi,意味着该分子完全不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的比值为1,而最后流出.当0<Kd<1,Ve=Vo+ViKd为处于两种极端行为之间的分子。

凝胶层析柱洗脱的三部分示意图

凝胶层析优点：1.凝胶本身不与样品发生化学反应。2.凝胶层析的操作条件较温和。3.样品得率高,重复性好。缺点：1.要求样品和洗脱液的粘度很低。2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用,如芳香族化合物与脂蛋白等。四、常用凝胶的结构与性能（一）葡聚糖凝胶：（二）琼脂糖凝胶（三）聚丙烯酰胺凝胶

（一）葡聚糖凝胶：

葡聚糖凝胶是用交联剂环氧氯丙烷使线状的葡聚糖之间通过醚键交联聚合成三维空间网状结构。葡聚糖凝胶三维网状结构网孔的大小取决于交联剂的百分含量。交联剂的百分含量高,交联度大,网状结构紧密,吸水后膨胀小,网孔小，分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百分比低,凝胶网孔大，分离物质的分子量也大。

琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶,其工作范围的下限是Sephadex的上限,可分离MW40万以上的物质,因此可用来分离核酸及病毒。琼脂糖凝胶不带电荷,不受微生物作用而降解,但对热不稳定,易受pH影响(只在pH4.5-9.0范围内稳定）.

Sephadex为葡聚糖凝胶的商品名，葡聚糖凝的型号表示每克干凝胶吸水值的10倍,如G-50表示每克干凝胶吸水量为5ml。主要种类：G-10，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，G-200Sephadex的化学性质稳定,不溶于水、盐、弱酸和碱,耐热耐碱但不耐酸。（二）琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)（三）聚丙烯酰胺凝胶

使用范围及效果同葡聚糖凝胶相似,但化学性质较葡聚糖稳定,可在pH2～11范围内使用。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P（Bio-GelP），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。五、凝胶层析的应用

1、分离纯化（蛋白质、核酸、氨基酸、多糖等）2、脱盐3、高分子溶液的浓缩4、测分子量（一）凝胶的选择凝胶颗粒的大小直接影响分离效果。细粒凝胶柱流速低，分辨率高，多用于精制分离或分析。粗粒凝胶柱流速高，分辨率低，多用于粗制分离，如脱盐等。凝胶层析经常遇到的两种分离形式。一种是将分子量极为悬殊的两类物质分开，如分离蛋白质与盐类，称作类分离。另一种是将分子量相差不大的物质分离，如将血清白蛋白与球蛋白分离，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。六、凝胶层析应注意的事项

凝胶层析有稀释作用，样品浓度应尽量大，但样品浓度过大往往导致粘度增大，使分辨率下降。对蛋白质样品浓度以不大于4％为宜。分析层析加样量为1～2mL/100mL柱床，制备层析加样量为20～30mL/100mL柱床，这样可使洗脱体积小于各组分样品之间的分离体积，可获得较满意的分离效果。

选用细长的柱作凝胶过滤。用来脱盐时，柱床高50cm较合适；分级分离时采用100cm柱床。柱床高与直径比值在7～10之间。（三）加样量（二）柱床高度

样品黏度对洗脱曲线的影响（1）浓度为5%，相对粘度11.8;（2）浓度为2.5%，相对粘度4.2;（3）浓度为1%.

洗脱的流速对分离效果有很大影响，下图显示了同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线。较快的流速冼脱峰较平宽。流速低洗脱峰窄而高。也就是说，流速低，分辨率高，样品稀释度小。

流速对洗脱曲线的影响

（四）洗脱的流速

洗脱的流速与洗脱的压力有关，与凝胶颗粒的粗细（型号）也有关。在同样的压力下，凝胶颗粒粗（型号小）的流速快；颗粒细（型号大）的流速慢。对于同种凝胶来说，在一定范围内，洗脱的压力加大，流速加快。

欲达到流速恒定的目的，可自制恒压加液装置（下图），更可靠的是使用微量恒流泵。

凝胶层析恒压加液装置

层析系统连接示意图1．密封橡皮塞；2．恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5．可调蜾旋夹；6.自动收集器；

7.检测仪

葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物，能被细菌和霉菌分解。聚丙烯酰胺凝胶本身不被微生物作用，但微生物能在凝胶床上生长，这样会破坏凝胶的特性，影响分离效果。为防止细菌生长和发酵，可用0.02％叠氮化钠、0.05%三氯叔丁醇（仅在弱酸有效，也适用于其他离子交换剂）或0.002％洗必泰、0.01％醋酸苯汞（在弱碱中有效，也适用于其他阴离子交换剂）以及0.1mol／L氢氧化钠溶液等作防腐剂。层析前再用水或平衡液将防腐剂洗去。

七、凝胶的再生和保养凝胶用过后，有几种保存方法：

湿态保存：在水相中加防腐剂，或水洗到中性，高压灭菌封存（或低温存放）；

半收缩保存：水洗后滤干，加70％乙醇使胶收缩，再浸泡于70％乙醇中保存；

干燥保存：水洗后滤干，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或60～80℃烘干）后保存。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块。第二节离子交换层析

ionexchangechromatography一、概念及原理：

利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同而进行样品分离的方法。

固定相：带有大量电荷的离子交换剂。流动相：具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。洗脱方法：增加离子强度、改变pH值。带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。

二、离子交换剂的种类

在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即成离子交换剂。（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂：带负电荷与阳离子交换阴离子交换剂：带正电荷与阴离子交换（二）按载体种类不同1、离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂苯乙烯+二乙烯苯

聚苯乙烯（单体）（交联剂）交联度=————————×100%二乙烯苯苯乙烯+二乙烯苯

交联度大，网孔小，大分子量的离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。在不影响分离的情况下，采用交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性。

阳离子交换树脂：

1、强酸型含磺酸基团(R-SO3H)2、中等酸型含磷酸基团(-O-PO2H4)3、弱酸型含酚基、羧基阴离子交换树脂：

1、强碱型含季胺基团[-N+(CH3)3]2、弱碱型含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2

阴离子交换树脂对化学试剂及热稳定不如阳离子交换树脂。

2、离子交换纤维素：阴离子交换纤维素:DEAE-纤维素pH8.6以下分离中性或酸性物质,具有二乙胺乙基。阳离子交换纤维素:CM-纤维素一般pH>4条件下使用,具有羧甲基。3、离子交换凝胶：分离大分子物质

葡聚糖（Sephadex）聚丙烯酰胺（PAG）琼脂糖（Sepharose）三、操作注意点

（一）离子交换剂的选择原则：根据被分离物质的性质选择对被分离物质各组分之间结合力差异大的交换剂，以保证通过离子交换层析后能得到比较满意的结果。考虑因素：1.被分离物质带何种电荷。2.被分离物质分子的大小，大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素。3.被分离物质所处的环境。4.被分离物质的物理化学性质。5.被分离物质的大概数量。根据分离过程的实验条件：强酸强碱：应用广泛弱酸型：只能在碱性pH范围内使用弱碱型：只能在酸性pH范围内使用

(三)洗脱剂原则：所用洗脱液比样品具有更活泼的离子或基团。改变pH或离子强度：降低被分离物与离子交换剂的结合力。洗脱方式：梯度洗脱（二）缓冲液的选择

原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致，避免使样品变性四、应用

分离蛋白质、多肽、氨基酸、核酸及其他小分子带电的物质第三节亲和层析AffinityChromatography一、概念：

亲和层析是利用生物大分子之间特有的专一亲和力而达到分离纯化的层析方法。二、亲和层析原理亲和层析是利用偶联亲和配基的介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法

配基（Ligand）:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。

基质(Matrix)载体:亲和层析中与配基共价结合使其固相化的物质。配基基质（载体）吸附

(Adsorption)

解吸(Elution)

亲和作用中的相互作用力1、静电作用2、氢键3、疏水性相互作用4、配位键5、弱共价键亲和作用体系特异性亲和体系高特异性酶--底物、产物、抑制剂抗原--单克隆抗体荷尔蒙--受体蛋白核酸--互补碱基链段群特异性免疫球蛋白--A蛋白、G蛋白酶--辅酶酶、蛋白质--过渡金属离子（Cu2+,Zn2+)凝集素--糖、糖蛋白、细胞表面受体三、载体的选择

应具备的特性：

1.有丰富的可供活化的化学基团，并在温和条件下能与配基共价结合。

2.惰性的，无非专一性吸附或足够小。

3.多孔网状结构。

4.良好的机械性能，具有好的液体流动性。

5.有较好的物理和化学稳定性。可供选择的载体

1、琼脂糖

商品名：Sepharose型号：2B，4B，6B型号含义：琼脂糖浓度为2%，4%，6%特点：亲水性强，理化性质稳定，网孔大，非专一性吸附小，只能以湿态保存，经不起有机溶剂处理。2、聚丙烯酰胺凝胶商品名：Bio-Gelp型号：P-100至-300型号含义：排阻限度，X1000相当于允许进入凝胶内部蛋白质的最大分子量特点：干胶，理化性质稳定,抗微生物侵袭能力较大,适用于配基和亲和物之间亲和力比较弱的系统,应避免在pH2-11以外的溶液中长期使用.3、葡聚糖凝胶商品名:Sephadex型号:G-100,150,200型号含义:每克干凝胶吸水量X10特点:理化性质稳定,耐热耐碱不耐酸,网孔小

1、小分子物质：辅酶、辅基2、大分子物质：酶、抗体3、纯化酶的配基:底物、酶活性中心、抑制剂、辅酶等；4、纯化抗原抗体的配基：互为配基5、纯化核酸的配基：DNA和RNA，蛋白质和mRNA常用的配基：四、配基的选择

应具备的特性：

1.对于欲纯化的生物样品具有专一亲和性

2.必须具备能被修饰的功能基团五、配基的固相化

固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于水的固相基质上制成固相化吸附剂。过程：活化、接臂

"插入剂"或"手臂"使小分子配基适当的离开载体骨架,克服载体空间位阻的影响六、亲和层析

（一）装柱和平衡（二）上样、亲和吸附（三）洗脱

1、非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、洗脱后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复到天然结构。

2、特异性洗脱：利用生物学特异只洗脱和配基专一结合的样品，不洗脱由于非专一吸附上去的杂蛋白。（四）再生亲和层析柱使用后可用大量洗脱剂连续洗涤，然后再用平衡缓冲液平衡，经处理后的层析柱能再次使用。七、亲和层析的应用

1.抗原和抗体

2.生物素和亲和素

3.维生素、激素

4.激素和受体蛋白

5.凝集素和糖蛋白

6.辅酶7.多核苷酸和核酸

8.氨基酸

9.染料配体

10.分离细胞、病毒

11.金属螯合色谱

12.共价色谱

1、纯化过程简单、迅速。

2、分离效率高。

3、实验条件温和。缺点：