第七章病理制片

病理技术在医学科研中的应用病理学科是一门基础与临床之间起着桥梁作用的重要学科，病理研究方法在技术工作上又是多方面的，有尸体解剖、大体标本的制作、制片（石腊切片、冰冻切片、半薄切片、超薄切片等）、组织化学方法，免疫酶标技术、荧光技术、摄影技术等。

作为实验技术人员大量的工作是病理制片技术，即常规病理切片、特殊染色，以供教学、科研、临床活检诊断之用。

第一章

病理技术的应用范围

帮助临床查明死因（原因不明的死亡）手术后病变标本，以明确诊断（临床活检）提供教学、科研的资料第一节组织制片的概述组织制片技术的应用，从1665年由HOOk发现细胞开始，已有300多年的历史。最早应用冰冻切片；随后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成石腊切片；后来又利用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质的韧性，以其包埋组织而制作切片。组织制片技术随着生物学和医学的发展而发展。切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。因此，组织制片技术是教学、医学和科研中不可缺少的一个组成部分。第二节制片的种类1、组织切片法

任何组织切片必须依靠切片机将组织切成薄片（厚度以μm计），再进行染色而得到结果。在切成薄片以前必须设法使组织内部渗入足够的支持物质，使组织保持一定的硬度，然后使用切片机进行切片。渗透到组织中的支持剂（物质）有多种，如石腊、明胶、火棉胶和塑料等。冰冻组织切片法是直接利用快速冷冻法进行切片。2、组织非切片法

不用切片机，不经过切片手续而制成组织切片的方法，包括整体封藏法、浮片法、压碎法和组织直接印片法。这些方法操作简单而快，可根据制片的需要进行选择使用。第三节制片方法的程序组织切片法制作过程中的各种操作1、取材与固定

取材是根据实验的目的和要求及病变程度而合理取得组织材料。固定是用化学药品把组织原来的结构保存下来，以便观察研究之用，固定剂同时具有硬化细胞组织的作用，使制片便于进行。2、洗涤与脱水

洗涤是把渗入组织中的固定剂洗去，防止染色中的结晶产生。脱水是驱除组织中的水分，以利于透明和浸蜡。3、透明与浸蜡（透蜡）脱水后的组织中水分已被透明可代替，而有利于浸蜡。浸蜡的目的是使组织有一定的硬度而有利于切片和细胞组织保持一定的生活时状态。4、包埋与切片

用石蜡和其他包埋剂将组织包绕一定的形状以便于切片。将包埋好的组织块用切片机切成一定的厚度（以μm计）。5、贴片（展片、捞片）和染色将已切妥的切片在温水中展平整后用载玻片贴上，稍晾赶后再烤片。染色可使细胞和组织被染上不同的颜色而产生一定的折射率，便于显微镜观察。6、封片

切片染色后用胶类物质将其封固，以利于长期保存。二、组织切片的主要程序

1.标本切开或取厚块→组织固定→固定后处理→（石腊切片法）脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→粘片→脱蜡→各级乙醇→水洗→常规染色或特殊染色→脱水→透明→树胶封片2．标本切开或取厚块→组织固定（冰冻切片法）→冰冻切片→粘片→乙醇固定及水洗→常规染色→脱水→透明→树胶封片。第二章

固定、固定液和取材第一节组织固定方法在制作组织切片的过程中，首先将组织充分固定后才能进行制片，尤其对石蜡切片，这是不可少的重要步骤。1、固定的意义

就是使要观察的组织构造尽量接近于它生前的正常状态。2、组织固定的目的

1）迅速防止组织，细胞的死后变化，防止自溶与腐败，以保持组织和细胞与正常生活时的形态相似。2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。4）固定剂兼有硬化作用，使组织硬化增加组织硬义，便于制片。

5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。6）经过固定的组织，能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辩认。由于固定的目的是在于尽量使组织和细胞保持与生活时相仿的成分和形态。因此，固定的组织愈新鲜愈好，固定组织时，应使用足量的固定液，其固定液的量一般不少于组织块总体积的4倍以上。3、固定剂的性质

为了能够达到固定的目的，必须具备以下的性质：1）迅速渗入组织而固定原生质，使短期解剖的组织形态不至于有较大变化。

2）固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。

3）使组织细胞中不至于因固定引起人为的改变。

4）在凝固原生质以后，增加细胞对于各种穿透的抵抗力，不至于因以后的处理而使固定后的原生质变形。5）尽可能避免使组织膨胀或收缩。

6）能使细胞内的成分（蛋白质）凝固或沉淀下来。

7）增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。增加媒染作用和染色能力。

8）使组织变硬，适于制片，但又不使材料太坚硬而松脆。

9）使组织充分固定，便于保存。第二节介绍几种常见固定液

固定剂有简单固定剂（液）和混合固定剂两类。作为较好的固定液，首先有强渗透力，能迅速地渗入组织内部；其次不会使组织过渡收缩或膨胀，并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质；最后能使组织达到一定硬度，获得较佳的折光率和对某些染料具有较强的亲和力。一、简单（单纯）固定液

1、甲醛（Ｆormeldehyde）

甲醛（福尔马林）为一种无色气体，溶于水成为甲醛水溶液，甲醛是一种还原剂，极易挥发旦有强烈刺激性气味。在平时常用的甲醛浓度为10%，这是指以10ml甲醛加入90ml的水配成的，此液实际上只有4%的甲醛。

甲醛水溶液渗透力强，固定均匀，对组织收缩较少。但经乙醇脱水时收缩很大，它能使组织硬化并增加组织的弹性。固定厚度适当的组织，较为适宜。因早醛为非沉淀性固定剂，它不能使白蛋的及抗蛋白沉淀；但可与蛋白质化合，对脂肪，神经，及髓鞘的固定很好，也可固定高尔基体、线粒体，又是复糖的保存剂，使肝糖元变为微细的颗粒团。

使用甲醛固定的陈旧组织，以多血的赃器如脾、肝等，较易发生黑色或棕黑色的沉淀，称甲醛色素。2、乙醇（Ｅthylalcohol）

乙醇为无色液体，可以水在任何比例下混合。它是一种还原剂，很易被氧化为乙醛，在变为醋酸，所以不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合。

用于固定时以80%—95%的浓度为好，它具有固定硬化脱水等多种作用。高浓度乙醇固定的组织硬化显著，组织在高浓度乙醇中留置过久，易变脆，也使组织收缩明显，均可缩小原组织体积的20%。因70%乙醇可较久的保存组织。另外，乙醇其渗透力较弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白。因此，乙醇除固定作用外，还具有硬化和脱水作用，所以它在制片过程中用途很大。3、醋酸（Ａceticacid）

醋酸又名乙酸，是带有刺激味的无色液体，因在室温15℃时常结成冰状——冰醋酸。特性：

（1）在15℃时成冰状结晶，有刺激性味，可溶水、乙醇一般配成5％作为混合固定液。（2）醋酸只能沉淀核蛋白，对染色质，固定较好，对白蛋白、球蛋白，固定不佳。对脂肪、糖元不能固定。

（3）醋酸能使组织膨胀，因此，可抵偿因乙醇、升汞、甲醛等固定液引起的组织收缩和硬化，故常配成混合固定液。

（4）醋酸穿透速度最快，米粒大的组织在单纯醋酸固定液中1—2h即可。5％醋酸的pＨ值在2≈8，此时可停止细菌和酶的活动，可防止组织自溶变性。4、氯化汞（Ｍercurybichloride）

氯化汞俗称升汞。为白色粉末或针状结晶，有剧毒，必须严格保管及注意使用。通常用其饱和水溶液，在室温的水中饱和度为5%—7%。特性：

（1）能沉淀蛋白质，它不能固定脂肪、类脂和糖类。

（2）穿透力较弱，单独使用可使组织收缩。因此，多与醋酸和铬盐（重铬酸钾）配成混合固定液，组织宜薄而小2—3毫米，固定6—18h。

（3）升汞混合液固定的组织对于细胞的结构，特别是核的细微结构，显示由为清晰。

（4）经升汞固定的组织易产生汞盐的沉着（为棕黑色结晶）易损害切片刀，因此染色前必须脱汞。5、苦味酸（Ｐicricacid）

苦味酸是一种黄色结晶，是一种相当强的酸。它在水中的溶解度随室温而变化，约在0.9—1.2%，在空气中能自燃，在密闭器中能剧裂爆炸。为使用安全起见，常制成饱和水溶液贮藏保存。特性:

1）能沉淀蛋白质，但对脂肪和类脂无固定作用。

2）穿透力很慢，细胞收缩显著，但不会使组织硬化。

3）有软化皮肤的作用，配制的Bouin氏液对头皮及全身皮肤制片效果甚好。

4）苦味酸固定的组织、固定时间太久会影响HE染色（苦味酸对碱性染料不易着色）。

5）苦味酸酒精饱和液为糖元较好的沉淀剂。6、丙酮

丙酮又名醋酮或本酮，极易挥发、易燃的无色液体，能与水、醇、氯仿、醚及多种溶液混合。特性：

1）它可以作固定剂，又可作脱水剂，穿透速度快，可使蛋白质沉淀凝固，2毫米以下的组织固定半小时至1小时即可。

2）可引起组织较强的收缩使之变硬，对核固定不佳。

3）对某些酶的固定很好，如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等。

4）丙酮一般多与氯化汞、甲醛混合液使用，先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定以减少组织收缩和过度硬化。7、重铬酸钾

1）为橙红色结晶，有毒，是强氧化剂，不能与酒精等还原剂混合，常配成0.5%水溶液固定组织。

2）重铬酸钾单独固定组织不能沉淀蛋白质，但加入冰醋酸转变为铬酸，（即酸化重铬酸钾），可使蛋白质凝固沉淀。3）重络酸钾与甲醛混合（临用时配过久失效）为未酸化的重铬酸钾固定剂，是固定线粒体、高尔基复合体和嗜铬细胞等优良固定剂，若配成Eenker氏液，能很好的固定细胞质、胞核及染色体。

4）重铬酸钾穿透速度快，固定组织收缩很小，但经酒精脱水时都有明显收缩。经重络酸钾固定的组织必须流水充分洗涤（6—12h），否则影响染色。

5）经重铬酸钾固定的组织，对酸性染料，如伊红染色良好，但对碱性料染，如苏木素较差，若加入升汞及醋酸等，则对细胞核染色极佳。

以上叙述了几种单纯固定液的性质和用途，它们各有其优缺点，但单独使用的不多，而混合固定液的应用更为广泛。单独固定液如重铬酸钾等单独应用效果不好，若与其他固定剂混合就可以成为优良的固定液。二、介绍几种常用的混合固定液1、乙醇——甲醛液（AF液）

配制：95%或无水乙醇90ml加入40%并装甲醛10ml为常用固定液，取材后立即入此固定液。

此液兼有脱水作用，用于固定肥大细胞和糖元较好，米粒大小固定4—6h，大块组织12—24h，固定后不经水洗，直接放入95%酒精开始脱水。2、AAF液

配制:纯酒精85ml+醋酸5ml+甲醛10ml3、Ｚenker氏液

配制:重铬酸钾2.5g+升汞5g+蒸馏水100ml加温溶解，冷却过滤，贮于棕色瓶内，成为贮存液。

用时取此液临95ml再加入冰醋酸5ml即成。

Ｚenker氏液为组织学、细胞学、病理学常用的固定液，多用于固定一般组织，能使细胞核和细胞浆染色较为清晰，固定时间12—24h，然后冲洗24h，切片脱腊后需脱汞（浸入5%碘酒精10’），脱碘（5%硫代硫酸钠）→流水洗。4、Bouin氏液

配制

苦味酸饱和液75ml+甲醛25ml+冰醋酸5ml

此液渗透快，组织收缩小，固定均匀，此液为常用固定液。它对肝、皮肤、胰脏特染效果好，但此液固定过久对碱性染料的着色有影响。5、Garnay氏液

配制

纯酒精60ml+氯仿30ml+醋酸10ml为细胞极好的固定液，对淋巴组织及腺体固定很好，米粒大的组织固定1—2h，也适宜RNA、DNA及粮元的固定。6、甲醛——生理盐水

配制

甲醛10ml+生理盐水90mlPH值为7此固定液是应用最广的一种，它可以保护脂类和细胞核。在作酸性染色时，入Ｖ-Ｇ，或三重染色之前，还可以再使用第2次固定。第六章洗涤、脱水、

透明、浸蜡和包埋、切片第一节组织洗涤一、洗涤的目的

组织在固定后一定要把渗透到里面的固定液洗去，然后再进行下一步过程。为防止组织中留有较多的固定液而影响脱水剂，甚至可在组织中发生沉淀物或结晶而影响观察，特别是对陈旧性标本更应注意流水冲洗，尽可能减少组织中的酸性程度和甲醛色素。对混合性固定液，更应及时洗涤，有利于脱水直至切片和染色。二、洗涤的方法1．固定剂以水配制者用流水冲洗，可使组织中的固定液随时溢出和随时洗去。常用的固定剂是甲醛液（10％甲醛水液），尸检组织、大动物组织冲洗时间为24ｈ左右，小动物组织冲洗时间为2--10ｈ左右。

2．固定剂含乙醇者乙醇或乙醇混合液固定液者，一般不要求冲洗，如需冲洗必需采用与固定剂中的乙醇浓度相近的乙醇冲洗，不可用水冲洗，也不应用浓度相差很大的乙醇冲洗。三、特殊固定液洗涤法1．重铬酸钾用重铬酸钾固定的组织可用流水冲洗12--24ｈ，或用亚硫酸，或用1％含水氯溶液进行洗涤。

2．苦味酸含苦味酸固定的组织，可用50％或70％乙醇浸洗。

3．氯化汞用氯化汞固定的组织内常有一种沉淀物生成，呈棱形或不规则或略圆的块状物，棱形物被认为氯化亚汞，不规则物可能是金属汞，此种结晶必需洗去，否则会使组织发脆，或染色不良。第二节组织脱水一、脱水的目的和原则

组织经固定和水洗后，会有大量水分，而水与苯根本不相融合，所以组织在透明前必须经过脱水这一环节。就是说用某些溶剂逐步将组织块吸收的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡或火绵胶的渗入，这一过程叫脱水。1．尸检及活检有条件时，将组织分别进行脱水，如脑、胰腺、肌肉、胸腺或淋巴结、肝、脾等组织。因为脱水时间差异性较大，最好是单独处理。

2．动物组织应区分动物大、小，如狗组织接近新生儿组织，大白鼠和小白鼠也有差异，前者需时稍长，后者则较短。3．脱水时间与脱水剂的关系脱水剂的新旧（纯度）影响脱水时间，必须灵活掌握。

4．穿刺组织如肾穿刺、径胃镜取得组织等，因组织块很小，常规用擦镜纸包裹，防止丢失。二、脱水剂的种类和效果

1．非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇和丙酮等，其组织在脱水后必须再经二甲苯透明才能浸蜡。

2．脱水兼石蜡溶剂的脱水剂如正丁醇等组织在脱水后即可直接浸蜡，不比经过中间溶剂如二甲苯之类的试剂。

脱水种类可根据须要选择，目前在病理诊断和实验性动物研究中，较多地采用乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡浸透组织。

脱水方法甚多，最重要的是不应骤然进行，不能操之过急，否则可引起组织强烈收缩，或使组织发生变形，而得不到满意切片。三、常用脱水剂的使用方法1、乙醇（Ａlcohol酒精）

沸点78.4℃，为最常用的脱水剂。脱水能力强，并能使组织硬化，能较好地与二甲苯透明剂相溶合。

其缺点是易使组织收缩、变脆。导致这些缺点是因为组织在高浓度乙醇（无水乙醇）中停留时间较长，或者加温脱水的温度过高。在日常中一般脱水从70%乙醇（人体组织从75%）开始，由低向高的梯度脱水。

一般的脱水顺序是：70%、80%、90%、95%①、95%②、无水乙醇①、无水乙醇②。只有脱水充分才能在透明剂中透明。2、丙酮（Ａcetone）

沸点为56℃。脱水作用比乙醇强，但是对组织的收缩较大，而价格较高，故一般少用于组织的脱水，主要用于快速脱水或固定兼脱水。脱水时间1—3h。3、正丁醇（Ｎ-Ｂutyl-alcohol）

为无色液体，沸点100—118℃，微溶于水，在100ml水中能溶8.3g，故脱水能力较弱，但能与水、乙醇及石腊混合，故这种脱水的组织块，可直接浸蜡包埋。

这种脱水剂兼透明剂的最大优点是很少引起组织块的收缩及变脆。第三节组织透明一、透明的目的

在制片过程中有两次透明，第一次是脱水以后组织块的透明，第二次透明是染色以后切片的透明。

组织块透明的目的是便于透蜡包埋，切片透明的目的就是有利光线的透过，便于显微镜下的观察。组织块在浸蜡前，必须通过透明以便使石蜡浸入组织内，起充分支持硬化组织块的作用，以便完整切片。

通常根据透明时间与肉眼观察相结合判断透明程度。二、常用透明剂的种类和使用方法

最常用透明剂的种类较多，但使用最多的是二甲苯。1、二甲苯

易挥发，无色透明液体，长期接触对呼吸粘膜有刺激作用。透明能力强，易使组织收缩、变脆，故组织块在二甲苯中不宜久留，特别对小动物组织材料必须严格控制好。2、甲苯

性质虽同二甲苯，但透明较慢，时间比二甲苯长一倍多，也易变脆。有时用以代替二甲苯。3、苯

苯的用途与二甲苯相似，对组织有较小收缩，是较好的透明剂。但也易挥发，易燃。吸入苯能引起中毒，可以较小使用。4、氯仿

即三氯甲烷。其透明能力比二甲苯及苯差，透明时间长达24h。不易使组织变脆，能溶于醇、醚、苯等，微溶于水、极易挥发。多用于大块组织的透明。5、香柏油

对组织收缩及硬化程度比任何透明剂小，但透明时间长，小块组织至少12h以上，缺点它不能溶解石腊，透明以后还需二甲苯补充透明。6、松节油、汽油

可作脱水，又可透明，但需用优质（无杂质）的工业汽油也不行，在条件困难时可试用。第四节、组织浸蜡（透蜡）浸蜡的目的和方法

组织经过脱水、透明后要用石蜡、火棉胶、碳蜡等支持剂透入内部,使其变硬并将组织包埋进去以利于切片和观察，这个过程称为“透入（浸蜡）”或“包埋”。

以石蜡切片的透入即（浸蜡）为例，其目的就是除去组织中“透明剂（如二甲苯等）而代之以石腊，并渗入组织内部，把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成薄片。

浸蜡的方法是将组织经过二甲苯透明以后，并立即投入到液体石蜡中去。在浸蜡时组织必须经过数次纯石蜡（石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），这样可以使石蜡中剩余的透明剂完全除尽，以免影响切片质量。浸蜡剂的种类

1、石蜡石蜡有高熔点和低熔点之分，一般普遍应用熔点为56℃以上的石蜡。低熔点在54℃以下，用于酶的显示和保存抗原活性。

石蜡分软蜡（52℃—54℃），硬蜡（56℃—58℃），蜂蜡60℃。

一般气温用硬蜡，气温低时用软蜡。

2、火棉胶目前使用火棉胶透入组织较少，用于染色前的覆盖液较多。

3、碳蜡

4、明胶第五节组织包埋

石蜡是动物植物、人体组织制片技术中极重要且应用最广的包埋剂。包埋蜡须在温箱内经多次熔化沉淀后的干净蜡，包埋较为理想，其包埋蜡熔点为56℃—58℃。

石蜡包埋的注意点：

（1）动作要迅速：特别是冬天，在有多块组织要包埋时，蜡很快会凝固，就包埋不成。

（2）切面向下埋：组织包埋要平整或按要求包埋。

（3）包埋的镊子必须加温，镊子温度又不能太高，否则会烧坏组织。

（4）包埋后待蜡块冷却后再放入冷水中，不能太快，否则变形有气泡。

（5）包埋时组织不能重叠挤压，否则切片不全会影响诊断。

（6）包埋用的蜡一般为工业蜡，气候炎热可用熔点高石蜡（60℃）

第六节

组织脱水透明和浸蜡时间

各种组织的脱水透明和浸蜡时间

表6-1尸体解剖组织脱水，透明和浸蜡时间表程序项目时间分配1234567891011121375%乙醇85%乙醇95%乙醇95%乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇二甲苯二甲苯二甲苯石蜡56℃—58℃石蜡56℃—58℃石蜡56℃—58℃时间长短均可

5—10ｈ5—10ｈ5—10ｈ2—5ｈ

2—5ｈ2—5ｈ30min30min--1ｈ30min--1ｈ1--2ｈ1--2ｈ2--4ｈ表6-2动物（鼠）组织脱水，透明和浸蜡时间表

程序项目时间分配1234567891011121375%乙醇85%乙醇95%乙醇95%乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇二甲苯二甲苯二甲苯石蜡56℃—58℃石蜡56℃—58℃石蜡56℃—58℃时间长短均可

2—5ｈ2—5ｈ2—5ｈ

20min30min30min15min10min10min1ｈ1--2ｈ1--2ｈ表6-3外检组织脱水，透明和浸蜡时间表程序项目时间分配1234567891011121370%乙醇80%乙醇90%乙醇95%乙醇95%乙醇无水乙醇无水乙醇二甲苯二甲苯二甲苯石蜡56℃—58℃石蜡56℃—58℃石蜡56℃—58℃3h

1—2ｈ1—2ｈ1—2ｈ1—2ｈ1—2ｈ1—2ｈ1ｈ1—2ｈ1--2ｈ1--2ｈ1—2ｈ2—4ｈ第七节

组织切片

一、石蜡切片法

1、切片前的准备工作

石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介作用。应先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，组织四周留2mm的石蜡边。

在常规实验室中须备以下用品

⑴经过清洁液浸泡过的载玻片。

⑵展片盆、染色架、蛋白甘油。

⑶大、中号毛笔、眼科镊（弯）

2、切片制作过程

⑴将预先冷却的组织装在切片机固定器上。

⑵切片组织经过粗切，待组织充分切完整，右手旋动切片机把，切片带出来之后，用毛笔轻轻托起，再用眼科镊轻摄蜡片，以正面放入展片盆中，待摊平整后捞片。

⑶捞片在载玻片上的二分之一以处。

⑷切片附贴后，放在空气中稍凉干，即可进行烤片。

3、切片的注意事项

⑴凡是陈旧、腐败或干枯的组织不易制好切片。

⑵固定失时或固定不当的组织，染色时常出现核质着色较浅、轮廓不清，出现不等的片状发白区。

⑶组织脱水，透明和浸蜡过渡，会造成过硬、变脆，特别是动物组织应严格控制。

⑷切片出现横皱纹常多见于组织固定不牢，或切片刀固定不紧。

⑸切片刀不锋利，切片时会自行卷起或皱起，更不能顺利地将切片联结成蜡带。切片刀如有缺口存在，更易造成切片断裂、破碎