分子诊断技术的临床应用

分子诊断技术的临床应用分子诊断利用分子生物学技术检测生物大分子主要指核酸(DNA和RNA)和蛋白质，从而对疾病作出诊断的方法称为分子诊断.

PCR技术核酸杂交技术DNA测序技术生物芯片技术蛋白质组学研究技术双向凝胶电泳生物质谱蛋白质相互作用的研究技术其它分子诊断技术毛细管电泳变性高效液相色谱生物大分子相互作用分析技术核酸和蛋白质分离纯化技术分子克隆分子诊断技术介绍在临床应用中日臻成熟和广泛荧光定量PCR核酸测序基因芯片PCR技术核酸分子杂交hybridization同源链异源链探针（probe）及应用是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。基于核酸杂交的分子诊断技术SouthernNorthern基因芯片FISH荧光定量PCR(FQ-PCR)实时荧光定量PCR技术荧光定量PCR反应体系的组成:模板引物酶

dNTPMg2+

探针/荧光染料

荧光化学

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针荧光染料荧光定量PCR技术之一5’3’RQ探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。λTaqManTM荧光定量PCR技术分子信标（molecularbeacon）荧光定量PCR实时荧光定量PCR仪荧光定量PCR反应体系的组成:模板引物酶

dNTPMg2+

探针/荧光染料SYBRGreenI荧光染料

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料。SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号。荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

生物芯片生物芯片（biochip）是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量核酸测序技术Sanger法测序Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。焦磷酸测序技术(pyrosequencing)基于核酸合成的实时测序技术第一步：加入测序引物和试剂第二步:每次加入一种dNTP，如果结合，则产生一个焦磷酸（PPi）第三步：硫酸化酶转化PPi为ATP，ATP使荧光素酶发出荧光(产生的光强度与结合的核苷数量成正比)第四步：多余的dNTP被降解，开始新一个循环主要特点：基于实时测序技术的检测和定量lighttime临床应用乙型肝炎的分子诊断乙肝病毒定量乙肝病毒分型乙肝病毒耐药分析HBV-DNA(病毒载量分析)HBV分型HBV耐药分析乙型肝炎的分子诊断

HBV-DNA(病毒载量分析)

实时荧光定量PCR

可以对任何时期乙肝病毒DNA拷贝数进行准确定量疗效监测和病程HBV基因分型和耐药检测HBV基因分型根据HBV全基因序列差异≥8%或S区基因序列差异≥4%，目前HBV分为A~H8个基因型在我国，A、B、C及D基因型HBV都存在，其中B和C型共占95%，A型很少见，至今未发现E、F、G和H基因型。北方城市以C基因型流行为主，由北方至南方，B基因型感染率逐渐升高

4.基因型与临床实验室表现不同（表2）病情与转归：C较B差抗病毒治疗：A优于DB优于Cadw/ayw20:1基因型检测意义：不同基因型HBV感染预后差异明显，C型感染者病情较重，与B基因型相比更易导致包括肝硬化、肝细胞癌（HCC）在内的严重病情；治疗前进行分型检测，根据分型结果选择合适的治疗方案；对干扰素应答不同，干扰素对C型患者的治疗效果较差，对B型患者的治疗效果较好。HBV分子诊断特征基因型BC流行性低高HBeAg阳性率低高HBeAg自然清除时间短长HBVDNA载量低高致病性轻重HCC发生率低（低年龄组高）高（高年龄组高）干扰素治疗完全应答率高低抗病毒治疗效果高低肝癌手术治疗预后好差癌栓栓塞治疗效果好差与HBV血清型比较，HBV基因型具有更加重要的意义。

乙型肝炎病毒的耐药性检测HBV分子诊断P区耐药突变位点的检测核苷（酸）类似物：拉米夫定（lamivudine)

阿德福韦（adefovir)

恩替卡韦（entecavir)

替比夫定（telbivudine)1、只有一个抗病毒靶点：HBVDNA聚合酶区（P）2、交叉耐药3、核苷类抗乙肝病毒药物不断问世HBV分子诊断拉米夫定耐药特点LAM耐药位点主要是rtM204V/I,可单独出现或联合

rtL180M、rtV173L/M和其他位点变异随着用药时间的延长，耐药变异发生率升高耐药变异往往是病毒学突破和临床突破的前奏不同基因型HBV发生YMDD变异率不同HBV分子诊断何谓YMDD变异在拉米夫定治疗期间，病毒DNA编码的DNA聚合酶基因序列发生了变异，这种变异在YMDD序列及其附近，因而称为YMDD变异。HBVDNA多聚酶逆转录酶结构域上酪氨酸－蛋氨酸－天门东氨酸－天门东氨酸（YMDD）上的突变，YMDD位于P区第549－522aa（即Y549M550D551D552），YMDD中蛋氨酸（M）被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）替代，变成YVDD/YIDD。即：Met—ATG

YMDD

Val—GTG

YVDD

Ile—ATT/ATC/ATA

YIDDHBV分子诊断YMDD变异是如何产生的？1、乙肝病毒发生YMDD变异自然形成的，未服用拉米夫定的患者体内也可能存在YMDD变异株。2、拉米夫定作为重要的选择性因素，使YMDD变异株成为优势病毒株。3、YMDD变异通常在拉米夫定治疗6个月后可能成为优势株。4、YMDD变异株累计发生率随用药时间延长显著增高。5、YMDD变异株成为优势病毒株的患者在停止服用拉米夫定后，YMDD野生株又可逐渐恢复成优势株。SiAhmedetal.Hepatology2000;32:1078–88600500200150100500876543061218243036拉米夫定治疗出现耐药的动力学变化月42病毒学突破MMMM/VLML/MMMM/VL亮MMV密码子180密码子204M蛋VALT(U/L)HBVDNAlog

copies/mL临床突破HBV分子诊断基因型耐药基因型耐药HBV分子诊断阿德福韦酯耐药现状ADV于2005年3月被SFDA批准在我国上市通过查阅CNKI2005-2009年国内相关文献，关于阿德福韦酯疗效的文章共32篇，其中研究对象大于20例的涉及耐药率和相关变异的论文仅5篇HBV分子诊断阿德福韦酯耐药特点我国对ADV耐药情况的随访时间较短我国CHB患者的ADV耐药株主要变异位点是rtN236T和rtA181V/T拉米夫定耐药患者，ADV耐药发生率明显高于初治患者国外报道HBeAg阴性患者对ADV的耐药发生率高于HBeAg阳性患者HBV分子诊断HBV分子诊断恩替卡韦耐药现状ETV与2005年11月被SFDA批准在我国上市查阅CNKI2005-2009年我国与ETV相关文献，多数研究（18篇）是应用ETV对LAM耐药患者进行治疗，关于随访耐药情况的报道较少见，仅2篇报道检测ETV耐药变异HBV分子诊断恩替卡韦耐药特点以ETV进行初治的CHB患者，罕见病毒学突破，耐药发生率低国外报道的ETV耐药多发生在LAM治疗失效或有YMDD变异的患者，同时需要多个位点置换才能发生临床耐药国内ETV耐药报道较少多数研究是应用ETV对LAM耐药患者进行治疗HBV分子诊断我国ETV耐药多发生在LAM耐药患者徐东平等对340例CHB患者HBV多位点耐药相关突变进行检测分析，结果显示，340例患者中，8例（2.4%）检出ETV病毒学耐药相关突变，且ETV病毒学耐药发生在LAM耐药基础上，以T184位点碱基替换最为常见徐东平，等中华肝脏杂志，2008，16：735-738HBV分子诊断替比夫定耐药现状替比夫定于2007年2月被SFDA批准在我国上市查阅CNKI2007年-2009年国内相关文献，因上市时间较短，多为关于LdT疗效的文章，少见有关CHB患者对LdT耐药情况的报道。仅1篇文章报道340例CHB患者检测出1例（0.3%)LdT耐药相关突变，变异位点为M204IHBV分子诊断HBV分子诊断

在治疗前，应制定合理的个体化治疗方案治疗过程中加强耐药检测和随访，及时预防和救治耐药，进一步提高CHB抗病毒的疗效HBV耐药变异的检测方法1.限制性片段长度多态性分析（RFLP）方法：

灵敏度低，不可检测出新位点的变异，操作繁琐

2.基因芯片方法：

有一定的假阳性和假阴性率，不可检测出新位点的变异3.荧光定量PCR方法：具有快速、准确、灵敏度高的特点，但目前只有能检测YMDD的试剂盒定量检测及YMDD变异检测试剂盒4.核苷酸序列测定法：

准确性、敏感性高，是基因突变经典的检测方法，该方法可靠直观，并可检测出多位点的变异，可发现新的变异位点，HBV分子诊断

什么时候进行突变检测？

治疗过程中每三个月继发性治疗失败（病毒突破）

抗病毒治疗之初（有无原发性耐药？）同时检测HBV病毒载量恶性肿瘤分子诊断年龄老年、儿童、新生儿

性别身高、体重环境因素食物/吸烟/合并用药

合并症病程

引起药物反应个体差异的机制器官功能基因型占70%决定因素恶性肿瘤分子诊断铂类、5-FU、吉西他滨……在血浆中或/和细胞中的代谢有明确的遗传学相关因素铂类GSTP1XRCCXPD5-FUTYMSMTHFR伊立替康UGT1A1吉西他滨RRM1紫杉醇CYP1B1ABCB1涉及细胞毒性作用机制的化疗药物恶性肿瘤分子诊断基因突变位点突变功能用药建议GSTP1（铂类）Val105val(9%)代谢率低疗效最好Ile105val(42%)代谢率中等疗效居中Ile105Ile(49%)代谢率最高疗效最差XRCC1399密码子（铂类）Arg399Arg（G/G）反应性强常规剂量Arg精399Gln谷氨酰胺（G/A）反应性一般建议加大剂量Gln399Gln（A/A）铂类抵抗建议换药XRCC1194密码子（铂类）Arg194ArgC/C反应性一般建议加大剂量Arg194Trp色C/T反应性强常规剂量Trp194TrpT/T反应性强常规剂量恶性肿瘤分子诊断基因突变位点突变功能用药建议XPD（铂类）Asp312Asp天冬（GG）修复低常规剂量Asp312Asn天冬酰胺（GA）修复中等加大剂量Asn312Asn（GA）修复快换药UGT1A1*28（依利替康）6TA/6TA潜在正常常规剂量6TA/7TA有毒副作用减量/换药7TA/7TA毒副作用增高建议换药恶性肿瘤分子诊断基因突变位点突变功能MTHFRC677T（5-FU）C/C低有效C/T低有效T/T高有效MTHFRA1298C（5-FU）A/A高有效A/C低有效C/C低有效恶性肿瘤分子诊断基因突变位点突变功能TYMSD（5-FU）+6/+6低有效+6/-6高有效-6/-6高有效TYMSE（5-FU）2R/2R高有效2R/3RC高有效3RC/3RC高有效2R/3RG低有效3RG/3RC低有效3RG/3RG低有效•

药物靶点基因:细胞靶向药物

药物(小分子/抗体/siRNA)−Kinase−Phosphatase−GPCR−NuclearHormoneReceptor−IonChannel−Protease−mRNA/microRNA：用siRNA可以作用于任意mRNA/microRNA恶性肿瘤分子诊断恶性肿瘤分子诊断

各种靶向药物主要是单克隆抗体和小分子化合物，在肿瘤治疗领域目前主要是：

1、生长因子受体通路抑制剂（EGFR、PDGFR、VEGFR、KRAS、her-2等）

2、血管生长抑制剂

各种靶向药物个体化治疗涉及的基因通路类别商品名英文通用名开发公司靶点单抗坎帕斯Campath阿仑珠单抗Schering、MillenniumCD52单抗阿瓦斯汀Avastin贝伐珠单抗GenentechVEGF单抗爱必妥Erbitux西妥昔单抗Imclone、Bristol-MyerssguibbEGFR-KRAS单抗麦罗塔Mylotarg吉姆珠单抗WyethCD33单抗泽娃灵Zevalin伊莫单抗CIDEC、PharmaceuticalsCD20单抗美罗华Mabthera利妥昔单抗GenentechCD20单抗百克沙Bexxar托西莫单抗GSKCD20单抗赫赛汀Herceptin曲司珠单抗GenentechHER2小分子化合物格列卫Glivec伊马替尼NovatisSTI571、Bcr-Abl、酪氨酸激酶抑制剂，CD117小分子化合物易瑞沙Iressa吉非替尼AstraZenecaEGFR小分子化合物特罗凯Tarceva厄洛替尼GenentechEGFR肿瘤靶向药物及作用位点单抗

Panorex依决洛单抗Centocor17-1A单抗

依帕珠单抗ImmunomedicsCD22单抗巯诺莫Verluma诺非单抗

SCLC抗体片段-NR-LU-10-Fab单抗

奥戈伏单抗

CA125小分子化合物多吉美Nexavar索拉菲尼Bayer酪氨酸激酶小分子化合物索坦Sutent舒尼替尼Pfizer酪氨酸激酶小分子化合物

Sprycel达沙替尼Bristol-Myerssguibb酪氨酸激酶小分子化合物万珂Velcade硼替佐米

26S蛋白酶体小分子化合物力比泰Alimta培美曲塞EliLilly叶酸小分子化合物

Ixempra伊沙匹隆Bristol-Myerssguibb内酰胺类似物小分子化合物

驮瑞塞尔Wyeth

小分子化合物

Tykerb拉帕替尼GSKEGFR/HER-2

恩度

endostar

烟台麦得津人血管内皮抑制素

Vectibix帕尼单抗AmgenEGFR肿瘤靶向药物及作用位点恶性肿瘤分子诊断抗EGFR-Kras单抗作用机制EGFR-Kras信号传导通路

恶性肿瘤分子诊断KRAS基因突变致抗EGFR单抗失效

KRAS位于12号染色体短臂上,编码35KD蛋白,其参与人类肿瘤的发生发展，类似分子开关野生型:能控制调控细胞生长；突变体:多发生在12、13密码子突变，导致恶性肿瘤细胞的生长和扩散，并且不受上游表皮生长因子受体（EGFR）的信号影响

恶性肿瘤分子诊断恶性肿瘤分子诊断Coden12-13CodenAminoAcidPhenotypeGGT-GGCGly-Gly甘WTGCT-GGCAla丙-GlyMTGAT-GGCAsp天冬-GlyMTGTT-GGCVal缬

-GlyMTAGT-GGCSer丝-GlyMTCGT-GGCArg精-GlyMTTGT-GGCCys半胱-GlyMTGGT-GACGly-Asp天冬MT公认的突变发生在密码子12和13，涉及3个核苷酸位点，共有8种形式恶性肿瘤分子诊断2008年6月，在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上发布了最新临床研究结果：K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益,反而徒增不良反应危险和治疗费用而K-ras野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益2008年10月，K-ras基因突变检测被写入最新版(2008年第3版)《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂（如西妥昔单抗和帕尼单抗）治疗

国内近40家检测中心已完成1000例K-ras基因检测，发现其中65.9%为野生型比国外偏低西妥昔单抗（爱必妥）+化疗治疗恶性肿瘤分子诊断KRAS突变检测方法PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)突变等位基因特异性扩增(MASA)快速扩增(SMAP-2)DNA测序恶性肿瘤分子诊断恶性肿瘤分子诊断DNA测序

检测KRAS基因突变对判断肿瘤的发生发展、预后以及治疗效果具有重要意义正常人中检出KRAS基因异常，提示存在肿瘤易感性良性肿瘤患者若检出KRAS基因突变，提示有恶变的可能KRAS基因突变阳性，即使病理组织学诊断淋巴结转移阴性，癌症复发的可能性也很高个体性治疗的极佳选择指标恶性肿瘤分子诊断恶性肿瘤分子诊断EGFR基因检测EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因C—erb一1(HER一1)的表达产物，是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一。它由1186个氨基酸残基组成，分子量为70000M，EGFR可分为胞外区、跨膜区和胞内区3部分研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关

EGFR作为肿瘤治疗中的靶点恶性肿瘤分子诊断EGFR激活及信号转导模式图MAPK途径

IKK途径

恶性肿瘤分子诊断全新概念：信号转导干预治疗即通过单克隆抗体、免疫毒素、酪氨酸激酶抑制剂、反义核苷酸等物质，针对信号转导通路中发生异常的环节来干预这种不正常的信号转导，从而达到抑制肿瘤生长的目的。目前针对于EGFR最常见的治疗方式:单克隆抗体－与EGFR结合，竞争和阻断EGF、TGFα等配体的结合，从而达到特异性抑制肿瘤生长之目的酪氨酸激酶抑制剂－EGFR酪氨酸激酶抑制剂可分为两大类：一类为非特异性酪氨酸激酶抑制剂，能抑制所有的酪氨酸激酶；另一类为目前使用较多的选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂，如吉非替尼和厄洛替尼等。

恶性肿瘤分子诊断酪氨酸激酶抑制剂的作用机制模式图

恶性肿瘤分子诊断易瑞沙（吉非替尼/阿斯利康）和特罗凯（厄罗替尼/罗氏制药）作为表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。大量临床试验表明，易瑞沙和特罗凯仅对30%~40%的非小细胞肺癌病人有显著疗效。但是，对具备EGFR突变的非小细胞肺癌病人而言，这两种药物治疗有效率可高达90%，而对表皮生长因子受体基因不存在突变的非小细胞肺癌病人，这两种药物的治疗有效率低，甚至无。

因此，检测EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药具有重要的参考价值

恶性肿瘤分子诊断EGFR常见突变位点

EGFR第18外显子片段长度为437bp，核苷酸2155G＞A突变（G719S）EGFR第19外显子片断长度为411bp，主要突变有：核苷酸2235-2249Del（E746－A750del）核苷酸2236-2250Del（E746－A750del）核苷酸2254-2277Del（S752－I759del）EGFR第21外显子，片段长度为399bp，主要突变有：核苷酸2576T－G（L858R）核苷酸2497T－G（L833V）核苷酸2504A－T（H835L）核苷酸2556位插入碱基G（q852）恶性肿瘤分子诊断EFGR基因突变检测方法特异性位点PCR特点：特异性和灵敏性高，但只能针对已知的突变位点设计特异引物进行检测，易污染荧光实时定量PCR特点：准确性、敏感性高，无污染，只能针对已知的突变位点PCR-SSCP特点：能够检测出比DNA测序法更多的突变数，成本较低，受实验条件影响较大，实验重复性差高效液相色谱法特点：较高的灵敏度和特异度、标本组织的要求降低，但不能判断具体的突变位点DNA测序法特点：检测EGFR基因突变“金标准”恶性肿瘤分子诊断EFGR基因突变检测意义采用表皮生长因子受体（EGFR）基因突变状态作为预测分子标志物，指导EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（TKI）针对EGFR的靶向个体化治疗对于EGFR突变阴性者：EGFR-TKI治疗无效对于EGFR突变阳性者：EGFR-TKI是无可替代的治疗选择（吉非替尼和厄罗替尼）

恶性肿瘤分子诊断HER2基因检测HER2：是表皮生长因子受体（EGFR）家族成员；

是一种原癌基因，位于17q21，编码相对分子质量185KD的跨膜糖蛋白（跨膜酪氨酸激酶受体）；

研究表明：30％以上的人类肿瘤中存在HER2基因的扩增/过度表达（如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等）；其中20％－30％的原发性浸润性乳腺癌有HER2基因的扩增/过度表达。恶性肿瘤分子诊断HER2的扩增和过度表达恶性肿瘤分子诊断HER-2检测方法

免疫组织化学(IHC)--HER2蛋白的表达荧光原位杂交(FISH)--HER2基因的扩增显色原位杂交(CISH)--HER2基因的扩增

恶性肿瘤分子诊断

美国FDA批准的检测Her2方法：

IHC法测定Her2过表达

FISH法定量检测Her2基因扩增恶性肿瘤分子诊断●HER2IHC评分3+的病例CISH扩增率在90％以上;而IHC2+的病例CISH扩增率为56.5％，IHC与CISH检测结果符合率为81.2％●对于国内赫赛汀治疗患者的筛选最好以IHC作为初筛，IHC2+再做FISH或CISH进一步证实恶性肿瘤分子诊断HER2的临床诊断意义：HER2作为乳腺癌预后的判断指标HER2作为治疗的靶点，根据其表达情况指导治疗其它肿瘤HER-2的情况

丙型肝炎的分子诊断丙肝病毒定量丙肝病毒分型丙肝病毒载量分析确定丙肝病毒感染的直接证据评价疗效的重要指标丙型肝炎病毒基因型分析HCV的基因型/亚型6个型，68个亚型1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t5a6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n基因型与干扰素的反应性

2a、2b、3a型对α-干扰素有明显的长期有效性，而1b型的反应性较差。欧美国家流行毒株多为1a型（Ⅰ或PT型），我国丙型肝炎流行毒株以1b型(Ⅱ或K1)、2a型(Ⅲ或K2a型)、6a型为主。HCV基因型与临床病情

1b型病毒易使患者导致肝硬化和肝癌；

1b型较非1b型易导致严重疾病。结核病的分子诊断分支杆菌菌种鉴定结核杆菌耐药检测分枝杆菌菌种鉴定

我国分枝杆菌感染11.1%是NTM(非结核分枝杆菌)。结核和NTM有相似的临床表现，但对于不同药物敏感性不同。目前关于NTM准确诊断的呼声越来越高。全球1/3的人已感染结核杆菌，活动性肺结核病人约2000万，每年新发结核病人约800-1000万，每年约有300万人死于结核病。结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。中国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第2位。结核杆菌感染率为44.5%，约5.5亿人已感染结核杆菌。结核病死亡人数为各种其他传染病和寄生虫病死亡总和的2倍。长期以来结核病之所以难以控制，其中一个主要的原因就是缺乏快速、准确的诊断方法，传统方法耗时长，准确度低，导致不能及时治疗或过度用药，另外结核分枝杆菌以外的分枝杆菌引发的肺部疾病越来越成为人们关注的课题。随着艾滋病发病率的升高，艾滋病毒与分支杆菌复合感染的病例也越来越多，根据临床发现其中很大一部分都是NTM。仅仅依据涂片抗酸菌阳性来诊断结核病，有可能将部分非结核分枝杆菌诊断为结核病。对临床难治的病例应进行分枝杆菌菌种鉴定，为治疗提供参考。非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌的临床表现相似，但是其抗结核一线药物的不敏感率非常高，同时对异烟肼和利福平的不敏感率达83.7%。为什么进行分支杆菌分型？结核分枝杆菌耐药检测快速检测MDR-TB可以指导合理用药；预防发生进一步耐药；预防MDR-TB的流行。我国第四次全国结核病流行病学调查显示，近1/3结核病人为耐药病人，1/10以上病人为耐多药结核。RFP（利福平）INH（异烟肼）SM（链霉素）EMB（乙胺丁醇）PZA（吡嗪酰胺）喹诺酮类已确定的耐药的抗结核药物结核分枝杆菌(TB)

的耐药监测

耐利福平：突变一般发生在RNA聚合酶B亚单位编码基因（rpoB基因）突变位点：531位丝氨酸亮氨酸

526位组氨酸酪氨酸突变导致RFP不能与RNA聚合酶B亚单位结合耐异烟肼：与三种基因突变有关katG基因（突变位点：463位精氨酸亮氨酸）inhA基因（突变位点：94位丝氨酸丙氨酸）ahpC基因结核分枝杆菌(TB)

的分子诊断

耐药监测扩增产物耐药基因分析SSCP（单链构象多态性分析）RFLP（限制性片段长度多态性分析）DNA序列分析基因芯片耐药基因的检测方法结核分枝杆菌(TB)

的分子诊断

耐药监测性传播疾病的荧光定量检测1.沙眼衣原体（CT）2.淋球菌（NG）3.人乳头瘤病毒（HPV6/11型）4.解脲支原体（UU）白血病融合基因利用RT-PCR或realtimePCR技术的

白血病融合基因检查

1、Bcr-abl融合基因检查

2、AML1－EVI1融合基因检查

3、PML-RARA融合基因检查

4、DEK－CAN融合基因检查

5、AML1-MTG8融合基因检查

6、E2A－PBX1融合基因检查

家族性乳腺癌基因的基因突变检查包括：

1、