第六章酶类生化产品制备技术

生化工艺学课件

第六章酶类生化产品制备技术第六章酶类生化产品制备技术§6.1概述§6.2酶的组成及分类§6.3酶的应用§6.4酶类生化产品的分离纯化方法§6.5木瓜蛋白酶的提取§6.6凝血酶的制备§6.7尿激酶的提取§6.8人尿激肽释放酶的提取、§6.9糜蛋白酶的提取、§6.10细胞色素c的提取§6.11超氧化物歧化酶的制备§6.1概述世界酶制剂厂著名公司：丹麦Novo公司、荷兰的Gist-Brocades公司、美国的国际Genencor公司、芬兰的Alko公司、德国的BayerAG公司、芬兰的Aultor公司、日本的天野制药和长濑产业等欧洲在酶工程领域的研究项目主要集中于脂肪酶和磷脂酶的生产和利用、高温菌中多糖类物质的生产、酶法生产中间体、与酶生产相关的微生物基因组的研究我国酶制剂生产企业上百家，仅占世界总份额2％左右工业用酶制剂：工业酶制剂的来源及特点已发现数千种，工业常用酶仅有数十种，目前大量生产的仅有十余种80％以上的工业酶为水解酶，用于降解自然界中的淀粉、蛋白质、脂肪等高聚物→淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶大多数酶是从微生物中获得的目前嗜极菌极端酶在酶制剂工业中迅速发展，第一个极端酶？（应用于PCR技术）酶制剂的等级工业级、食品级、医药级食品级与医药级酶制剂纯度要求严格，且要进行产品毒性和安全性的评价，新型微生物在食品和医药界的应用，须得到法定机构的安全性确认→大多食品工业微生物的生产仅限于11种真菌、8种细菌、4种酵母菌在识别与出售时，酶的指标为催化活力，而非重量→储存时生物活性与稳定性非常重要一般而言，含杂蛋白的酶制剂比纯品稳定，干燥品比液体制剂稳定酶制剂品种的开发1）食品加工用酶：生产低聚糖的酶，如葡萄糖转苷酶、（低聚异麦芽糖）、β-果糖基果糖转移酶（乳果糖）以及环糊精转移酶的蛋白质修饰，以得到α、

β、γ环状糊精2）饲料用酶：NSP酶、植酸酶等3）纺织及洗涤剂用酶：eg.原果胶酶，既可除去对皮肤有刺痛作用的原果胶质，又可提高染色性；碱性丝氨酸型蛋白酶、碱性脂肪酶、碱性纤维素酶和淀粉酶现已扩展到洁具、厨具相关领域4）临床诊断、治疗用酶、化妆品用酶：风险较大，但成功后效益较高§6.2酶的组成及分类按酶的组成分类按酶所催化反应的类型分类按其功效和临床作用分类：消化酶：胰酶、胰酯酶、胃蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶等抗炎、黏痰溶解酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、超氧化物歧化酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、核糖核酸酶等抗凝或止血酶：链激、尿激酶纤溶酶等；凝血酶、促凝血酶原激酶。§6.3酶的应用助消化酶类生化产品：补充内源消化酶的不足，促进食物中各类营养物质的吸收、治疗消化器管疾病及各种原因引起的食欲不振、消化不良，如胃蛋白酶、胰酶、凝乳酶、纤维素酶和麦芽糖淀粉酶等——多酶片消炎酶类生化产品：蛋白酶作为抗炎剂；溶解黏痰作用酶心血管疾病治疗酶类生化产品：弹性蛋白酶、激肽释放酶、溶栓酶、凝血酶抗肿瘤酶类生化产品：L-天冬酰胺酶治疗淋巴肉瘤和白血病；谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶、组氨酸酶、酪氨酸氧化酶5、其它酶类生化产品：SOD、PEG-腺苷脱氢酶、DNA酶、RNA酶、细胞色素c、青霉素酶等6、辅酶类生化产品：NAD、NADP、FMN、FAD、泛醌、辅酶A7、临床诊断酶类生化产品：氧化酶、脱氢酶、激酶、荧光酶，用于测定20多个化验项目测定某一项目时需要一个或几个酶的配合，组成一个酶反应系统→测定一个最终反应产物→酶试剂盒eg.胆固醇氧化酶（链霉菌发酵液）＋胆固醇酯酶（猪胰）测定血清中总胆固醇的酶试剂盒§6.4酶类生化产品的提取分离方法酶的提取分离包括5步：原料的选择、酶生物原料的预处理、提取、纯化或结晶利用酶的催化活性作为选择提纯方法和操作条件的指标，在提取和纯化过程中，应随时测定总活力和比活力→了解每一步的收率和纯度→分析和决定下一步工艺的取舍生物细胞中酶的总量不少，但每一种含量非常小，大都在0.0001%-1%一、酶的原料选择不同酶的用料选择：原材料来源丰富，含量较高；不同生长发育情况及营养状况：微生物制酶时需测定酶活力来决定取酶阶段，动物器官提取酶则与动物年龄及饲养有关动植物提取酶收到原料的限制，工业生产的重点已逐渐转向微生物（不受季节、气候和地域限制，生产周期短、产量高、成本低，能大规模生产）二、酶的预处理、提取纯化动物组织经丙酮迅速脱水制成丙酮粉（冷丙酮低温处理），低温储存数年；微生物大量保存时可采用干燥法（细胞自溶、增加酶释放）一个好的方法应该：比活力提高大、总活力回收高、重复性好；不要重复同一步骤或同一方法（不但不能去掉不同种类的杂质，还会使酶总活力下降）在逐渐纯化过程中，随着杂质的去除，蛋白质总浓度下降，相互稳定性也随之减弱，酶易于失活酶的纯度用比活力来表示，比活力越高，酶纯度越高每一操作步骤尽量测定三个指标：总蛋白、总活力、比活力，在提纯的过程中，上述指标的变化趋势如何？酶的纯度鉴定一般采用电泳法或HPLC法纯化倍数、产量的定义三、酶的纯度与产量§6.5木瓜蛋白酶的提取由植物番木瓜叶精制而得得蛋白酶混合物——一种巯基蛋白酶，专一性差，能分解比胰蛋白酶更多的蛋白质EDTA、半胱氨酸、亚硫酸盐为激活剂，等电点9.6能将纤维蛋白溶酶原激活为纤维蛋白溶酶，促进伤口愈合，治疗水肿木瓜蛋白酶的应用1）在啤酒麦汁制造中加入酶，对麦芽的糖化力有明显的提高，能加快过滤使滤渣较爽。在固态发酵的白酒，黄酒，酒曲生产中酶，与酒曲（酒母）和糖化酶，调匀加入米饭（原料）中，可缩短发酵时间，提高出酒率和酒精度，酒质口感醇和。2）在淀粉浆中加入酶，水解2小时，可降低淀粉的蛋白质含量。整粒或破碎的玉米粒每吨加300-500克酶浸泡24小时，提高淀粉收得率，减少淀粉中的蛋白质含量。3）茶叶加工的应用：喷洒在茶叶上，拌匀后揉制发酵。可缩短发酵时间15-20分钟，茶汤色明亮，香气和口感更好，茶垢减少。4）制烟中的应用：卷烟生产中兑水稀释喷洒，可使烟的香味醇厚，刺辣味减少，提高烟叶等级。木瓜乳汁粗制上清液（木瓜凝乳酶）木瓜蛋白酶粗品精制工艺一木瓜蛋白酶的精制提取工艺盐析滤液（弃去）蛋白酶结晶精制不溶物（弃去）滤液加入激活剂、离心或过滤除不溶物，pH9.0做(NH4)2SO4饱和度实验45％(NH4)2SO4沉淀上清液（弃去）沉淀pH9.0做(NH4)2SO4饱和度实验，下限去杂，上限沉淀木瓜酶加入激活剂过滤木瓜乳汁提取不溶物（弃去）木瓜蛋白酶滤液精制工艺二精制上清液（弃去）沉淀产品干燥0.03M半胱氨酸，pH6.5NaCl盐析实验一、体内的凝血过程凝血过程包括三个基本的生化反应：①凝血酶原激活物的形成；②凝血酶原激活物在钙离子的参与下使凝血酶原转变为有活性的凝血酶；③可溶性的纤维蛋白原在凝血酶的作用下转变为不溶性的纤维蛋白。凝血机制的研究，促进了对许多出血性疾病的认识，如血友病的成因，主要是由于血浆中缺乏凝血因子Ⅷ。凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ都在肝脏中合成，在它们形成过程中需要维生素K参与。缺乏维生素K，将会出现出血倾向。§6.6凝血酶的制备凝血机制血液凝固性球蛋白，人血清中几乎不存在，而在牛血清中则含有这种球蛋白分子量66kDa的糖蛋白，单链，在凝血酶原激活因子催化下，Arg274-Thr275和Arg323-Ile324断裂，释放出274个a.a，产生活性凝血酶，A链49a.a，B链259a.a在实验室或临床工作中，可按需要针对凝血过程中的各个环节，采取不同措施，达到延缓凝血或有效止血的目的。手术后为防止出血，可在手术部位施加凝血酶、纤维蛋白等凝血物质，还可用温热的纱布、棉花或明胶海绵按压伤口促凝止血。血液凝固或血凝是指血液由流动的液体状态转变成不能流动的胶冻状的过程。血液凝固后1～2小时，血凝块会发生回缩，并释出淡黄色的液体，称为血清。血清与血浆的区别？前者缺乏参与凝血过程被消耗掉的一些凝血因子和纤维蛋白，但增添了少量血液凝固时由血管内皮细胞和血小板释放出来的化学物质，人体中血清不可以再凝。二、临床或实验中的止血环节§6.7尿激酶的提取（urokinase）蛋白水解酶→血纤维蛋白溶酶原→血纤维蛋白溶酶碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物尿中，临床的主要应用是溶血栓、抗凝血作用（还可降血压？）日本采用亲和层析，收率较高；美国采用人胎儿肾细胞培养，近年来将尿激酶的基因成功地转移到细菌中得到表达。尿中含量很低→关键选择合适的吸附剂采用硅藻土或树脂吸附法尿激酶活性测定纤维素平板法：琼脂糖＋纤维蛋白原＋凝血酶→凝结成为纤维膜→加入不同浓度的尿激酶标准溶液及待测样品→37oC培养箱中保温18h→测量每个溶圈垂直的直径待测样品应与