第三章-抗体的制备与纯化技术

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第二篇分子免疫学技术授课内容一、特异性抗体的制备与纯化技术二、蛋白质研究水平的分子免疫学技术四、基因组和蛋白质组研究水平的分子免疫学技术授课方式：讲授、自学、演示相结合三、DNA研究水平的分子免疫学技术第三章特异性抗体的制备与纯化技术绪论特异性抗体：多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体（杂交瘤技术）基因工程抗体第一节多克隆抗体的制备与纯化多克隆抗体：由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同抗原决定簇的抗体的混合物，即多克隆抗体。多克隆抗体（抗血清）的制备流程

抗原半抗原+载体

佐剂免疫动物（3-5次）

测效价

动物采血，分离血清

抗血清纯化、鉴定、保存一、抗原制备1、抗原的制备

1）细胞性抗原或颗粒性抗原：细胞性抗原主要包括人、动物的细胞，还有细菌、螺旋体及寄生虫等。如菌体（O）抗原的制备：选择标准菌株，接种于斜面或平板培养基表面；置温箱37℃

培养24h，用适量的无菌生理盐水刮下菌苔，移入无菌含有玻璃珠的三角瓶中，充分摇匀菌体；100℃

水裕2～2.5h杀菌并破会鞭毛抗原。取处理过的菌液，检测有无活菌的存在，合格后用无菌生理盐水稀释成每毫升8亿～10亿个细菌，加入苯酚至最终浓度为5％，即为O抗原。

2）可溶性抗原

可溶性抗原主要包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、补体、细菌外毒素、核酸等。它们大多数来源组织细胞，成分复杂。制备这类抗原时，首先需将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的成分，提纯后的抗原需鉴定后才能用做免疫原。

（1）组织匀浆的制备：所有的组织必须是新鲜的或低温保存的。器官或组织获得后立即去除表面的包膜或结缔组织以及大血管，在4℃水浴或冰浴中将洗净的组织剪成小块，加入适量生理盐水，装入捣碎机破碎制成组织匀浆。

（2）细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常用方法有冷热交替法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和酶处理法等。超声破碎：一次超声1～2min，总时间为10～15min。（3）蛋白提纯

①

超速离心法：常用密度梯度介质有蔗糖、甘油、CsCl；②选择性沉淀法（盐析沉淀法）：其原理是根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。如选用33～50％饱和度的硫酸胺收集沉淀物；③凝胶层析法（分子筛层析）：蛋白质分子按大小被分离；④离子交换层析；带电的生物大分子和离子交换色谱填料上的离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离

⑤亲和层析：利用生物大分子的生物特异性如抗原抗体、激素受体、IgG和葡糖球菌蛋白蛋白A（SPA）；⑥制备电泳技术。

⑦其它聚丙烯酰胺凝胶胶内蛋白

可将抗原所在的电泳条带（或蛋白点）切下,研磨后直接用以动物免疫。NC膜结合蛋白

将含目的分子的蛋白进行SDS电泳，转移至NC膜上，丽春红显色至清晰显示目的条带，取目的条带置于加有PBS的1.5ml离心管中，用PBS洗至无色，继而剪碎、研磨，用于动物免疫。（4）纯化抗原的鉴定含量测定：采用常规蛋白或糖类浓度测定法，一般采用分光光度计测量法；相对分子量的鉴定：一般采用SDS电泳法；纯度鉴定：常用区带电泳法鉴定。3）半抗原半抗原物质多数为低分子质量的物质，如：多糖、多肽、甾体激素、脂肪胺、类脂质、核酸、某些药物及其它化学药品；常用载体：蛋白质类如：牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白等。多肽聚合物：如多聚Lys

大分子聚合物：如羟甲基纤维素；半抗原－载体连接方法：常用物理法和化学法，物理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微孔吸附半抗原，化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上。

2.佐剂

1）定义：与抗原同时或预先注射于机体能增强机体免疫应答或改变免疫类型的物质.2）良好的佐剂应当具备以下条件：（1）增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；（2）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，降低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；（3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫；（4）具有无毒性或副作用低的特点。3）常用佐剂的种类和制备应用最多的是福氏佐剂和细胞因子佐剂

福氏佐剂：不完全佐剂:液体石蜡+羊毛脂完全佐剂:液体石蜡+羊毛脂+卡介苗福氏佐剂：抗原=1：1乳化成“油包水”乳液（乳化方法主要有研磨法和注射器混合法）。完全佐剂一般不连续2次使用

细胞因子佐剂

IL-2IL-1IFNrCSF等二、免疫血清的制备1、免疫动物的选择和饲养选择动物:哺乳类和禽类

1)适龄、健壮、无感染

2）抗原与免疫动物种属关系：差异越远越好

3）抗血清量的需要：量大，选用马、羊等大动物，量小，选用兔、豚鼠

4）实验考虑：如要利用所制备的抗体进行免疫沉淀实验，则不同种属的抗体与蛋白A（SPA）的结合能力不一样，如人IgG、兔IgG、猪IgG

、狗IgG

、猫IgG

、驴IgG等与蛋白A强烈结合，而羊IgG、牛IgG等与蛋白A较弱结合，鸡IgG不能与蛋白A结合。

5）抗血清分为R（rabbit）型和H（horse）型，R型免疫血清具有较宽的等价带，适于做诊断试剂；H型免疫血清等价带较窄，一般用于做免疫治疗。2、免疫方法

剂量：合适，太大，易引起免疫耐受途径：多用皮内或皮下多点注射（足掌、背部两侧）腋窝淋巴结直接注射静脉、腹腔注射间隔时间：第一次免疫（完全佐剂）

10-20天第二次免疫（不完全佐剂）

7-10天第三次，总次数5-8次。3、免疫血清采集、分离及保存1）采血前测抗体效价在第2次加强免疫后2周，从兔耳缘静脉取2～3ml血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。

抗血清的效价：就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双向扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。放射免疫法：

以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原（放射性核素标记）混合，孵育24h后，测定其结合率（用液体闪烁计数仪测定Ag*－Ab或游离Ag*）。通常以结合率为50%的血清稀度为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起注意。

双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。

琼脂板的制备：100mlpH7.1的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65℃左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔内加适量抗原（容量为50μl），周围各孔内分别加入50μl1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度。2）抗血清的采集、分离和保存采集：颈动脉放血、心脏采血、静脉采血分离：室温自然凝固1～2h，然后放4℃冰箱过夜，待血块收缩后分离血清，有些血清须经56℃30min使补体灭活。保存：4℃保存—存放3个月至半年低温保存—2至3年，忌反复冻融冰冻干燥—4-5年3）免疫失败的可能原因及应采取的措施有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。

（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。

（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。

（3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。

（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。

（5）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。

（6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。

三、抗体的纯化和鉴定1、目的：尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分2、纯化方法1）单价特异性抗血清的纯化单价特异性是指抗血清只与其特异性抗原发生反应。去除杂抗体主要方法：亲和层析法（将引起交叉反应的共同抗原交联到Sepharose4B柱上，把要处理的抗血清通过亲和层析柱，共同抗体吸附在柱上，洗脱液则含有特异性抗体）；

吸附法（指将非特异性抗原液与戊二醛制备成固相吸附剂按1：10直接加到免疫血清中去除杂抗体）硫酸铵盐析：先用50%饱和度去除白蛋白，再用2次33%饱和度沉淀丙种球蛋白。离子交换层析：常用的离子交换剂有DEAE纤维素和QAE纤维素。以QAE-Sephadex最理想。能吸附血清中多种蛋白质，但不能吸附IgG.亲和层析法：将纯抗原（或SPA)交联到Sepharose4B，装柱后，将抗血清通过亲和层析柱，特异性吸附IgG。凝胶过滤法：分子筛层析2）特异性IgG类抗体的纯化3、抗体鉴定抗体效价的鉴定；如双向扩散等抗体特异性鉴定：用交叉反应率来表示；抗体纯度鉴定：可用PAGE电泳或SDS电泳鉴定；抗体亲和力鉴定：抗体亲和力是指抗原、抗体结合牢固的程度。亲和力越大表示抗体与相应抗原结合越牢固。抗体亲和力大小常以亲和常数K表示，K的单位是升/摩尔。在RIA（放射免疫技术）测定时，K是该抗血清能达到的最小检出量的倒数。K的范围在108～1012L/mol之间。

四.多克隆抗体的应用与问题一）应用免疫学检测被动免疫治疗和紧急预防二）存在问题

特异性差,用于免疫学检测容易出现交叉反应

第二节单克隆抗体

(Monoclonalantibody,McAb)一.概念:

通过B细胞杂交瘤技术,获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体.二.B细胞杂交瘤的类型

小鼠-小鼠大鼠-大鼠小鼠-人人-人

三杂交瘤技术的原理

1.亲本细胞的选择

小鼠骨髓瘤细胞次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核苷转移酶

(HGPRT)缺陷型

免疫脾细胞经抗原免疫的BALB/c小鼠的脾脏（抗原制备方法同多克隆抗体制备方法）BALB/c小鼠简介

1913年，贝格(Bagg)从美国商人欧希尔(Ohio)处购得的白化小鼠原种，以群内方法繁殖。麦克·多威尔(MacDowell)在1923年开始作近交系培育，至1932年达26代，命名为BALB/c品系。安德尔文特(Andervont)等人使BALB/c广为传播和应用。1985年我国从美国NIH引进到中国医学科学院实验动物研究所，为BALB/c第180代。

毛色：白化。

主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，但用乳腺肿瘤病毒诱发时发病率高;卵巢、肾上腺和肺的肿瘤在该小鼠有一定的发生率。②易患慢性肺炎。③对放射线甚为敏感。④与其他近交系相比，肝、脾与体重的比值较大。20月龄的雄鼠脾脏有淀粉样变。⑤有自发高血压症，老年鼠心脏有病变，雌雄鼠均有动脉硬化。⑥对鼠伤寒沙门氏菌补体敏感，对麻疹病毒中度敏感。对利什曼原虫属、立克次氏体和百日咳组织胺易感因子敏感。

主要用途：广泛地应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学研究，以及单克隆抗体的制备等。

2.细胞融合骨髓瘤细胞

PEG

脾细胞融合后细胞的类型:

未融合的脾细胞杂交瘤细胞未融合的瘤细胞

杂交瘤细胞3杂交瘤细胞的选择性培养

DNA合成的途径：糖+氨基酸氨基喋呤

(Aminopterin,A)

TK核苷酸DNA

胸腺嘧啶核苷TMP(Thymidine,T)

核苷酸前体

次黄嘌呤

HGPRTIMP(Hypoxanthine,H)融合后细胞在HAT培养基[次黄嘌呤（hypoxanthine）、氨甲蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶核苷（thymidine），故名HAT培养基]中存活情况（脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。）脾细胞（HGPRT+,TK+,不能长期生长）骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+

，能够生长）4.杂交瘤细胞的筛选和克隆化

1）筛选：

在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。

检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。2）克隆化杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

克隆化的方法主要有：有限稀释法、单个细胞显微操作法、软琼脂培养法有限稀释法克隆

（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。

（2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。

（3）调整细胞为3～10个细胞/ml。

（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中

。

（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。

（6）8～9天可见

细胞克隆形成，及时检测抗体活性。

（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。

（8）每个克隆应尽快冻存。

软琼脂培养法克隆

（1）软琼脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640。

①1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

②0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

（2）用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

（4）1ml0.5%琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。

（5）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

（6）4～5天

后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。

（7）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。

5.单克隆抗体的生产

大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10～60μg/ml,如果大量生产，费用较高。

（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

①实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆

抗体的含量可达到1～10mg/ml。但采血量有限。

②腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。

6.单克隆抗体的纯化硫酸铵沉淀法离子交换层析

A蛋白-Sepharose亲和层析7、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定：

1）抗体特异性的鉴定：除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

2）McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3%），更有利于沉淀线的形成。

3）McAb中和活性的鉴定：用动物或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如，如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

4）McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验，测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

5）McAb亲合力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲合力。

8、影响因素、失败原因分析

由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。其主要失败原因和影响因素有:

1.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。

2.融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。

3.杂交