分子病理学临床应用

分子病理学的临床应用长江大学附属第一医院荆州市第一人民医院李军川1概念——

来自于临床

肿瘤个体化诊治异质性全面了解整体解决2基层医院-分子病理学面临现状主要满足基本医疗需求注重疾病一般诊治资金困境“分子学”，离得很“远”？“高大上”，没去了解、应用3概念——

来自于基础遗传染色体基因芯片分子分子学分子生物学分子病理学分子免疫学转化医学分子药理学4生物大分子：核酸、蛋白质基因（gene)：核苷酸序列——贮存遗传信息，贮存蛋白质多肽链或RNA序列信息分子生物学：分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律医学分子学：分子水平开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的科学。交叉学科包括：分子免疫学、分子病毒学、分子病理学和分子药理学等有关名词5形态学

免疫分型免疫组化

基因定性、定量基因突变检测基因芯片检测……免疫学细胞遗传学分子生物学

组织学细胞学特殊染色

核型分析荧光原位杂交MICMCM传统病理学（MI）现代病理学（MICM）分子病理学（20世纪70年代初）6概念基因突变：点突变，缺失，插入，倒位，配子突变和体细胞突变，动态突变

基因芯片：人工合成的碱基序列基因检测：血液、体液细胞DNA/RNA的技术基因诊断：DNA/RNA水平检测基因，基本技术：核酸分子杂交和PCR扩增

基因诊断应用于肿瘤：1、染色体异位及融合基因。2、癌基因和抑癌基因。3、肿瘤相关病毒。4、肿瘤标志物基因或mRNA

7临床应用目的：诊断清楚，治疗有效标本多来源于病理科标本，包括组织学和细胞学，另外还有外周血等转化医学（20世纪90年代）：将基础研究与解决患者实际问题结合起来，将基础研究的成果“转化”为实际患者的疾病预防、诊断和治疗及预后评估。转化医学的中心环节是分子生物学的研究。关注分子学：不只是别人的事8熟悉：一些有关分子病理学的名词分子诊断：滑膜肉瘤：SYT-SSX融合基因，淋巴瘤：

基因重排原位分子杂交——HPV

EBVFISH——Her-2基因测序——EGFR……9临床常用分子学技术

免疫组织化学（IHC）技术－检测蛋白分子原位杂交－DNA，RNA

荧光原位杂交（FISH）技术－DNA，RNA荧光定量PCR－DNA，RNADNA测序技术－DNA突变生物芯片技术－DNA，RNA，蛋白质等10精准医疗（精确医疗）指以个人基因组信息为基础，结合蛋白质组、代谢组等相关内环境信息，为患者量身设计出最佳治疗方案，以期达到治疗效果最大化和副作用最小化的一门定制医疗模式。医疗的决策、实施等都是针对每一个病人个体特征而制定的，疾病的诊断和治疗是在合理选择病人自己的遗传、分子或细胞学信息的基础上进行的。在生物分子基础上的、因人因病而异的、更加精确的个体化医疗。11肿瘤超早期筛查早期诊断及辅助诊断

预测药物反应性，指导临床用药（放化疗及靶向治疗）预测预后

肿瘤分子分型分子病理学检测的临床应用——个体化医疗12风险预测我是否易得某种疾病？复发监控疗效判断治疗选择预后判断临床分期鉴别诊断早期筛查我的疾病会如何进展？我现在是否可能有疾病？我的疾病是什么类型的？我的疾病进展了吗？我的疾病回来了吗？我的治疗起作用了吗？最适合我的治疗是什么？个体化诊疗系统化解决方案13问题：我们是否易得某种疾病？肿瘤遗传筛查

14肿瘤遗传筛查

15肿瘤具有遗传性：肿瘤分为散发性及家族性，家族性肿瘤大多由遗传因素引起，少数由其他因素引起（如家族性肝癌与肝炎病毒在家族中传染）遗传性肿瘤的危害——患癌风险大幅提高遗传性肿瘤的特性：

符合垂直传递规律，即肿瘤按常染色体显性遗传（AD）发病年龄较早（早于该肿瘤在普通人群中的平均发病年龄）多为双侧或多发性，散发性肿瘤多为单侧或单发16遗传性肿瘤综合分子检测项目79个基因、6万个位点15种肿瘤17曾外祖母、外祖母:死于癌症母亲:BRCA1突变,56岁死于乳腺癌；阿姨：BRCA1突变,61岁死于乳腺癌；朱莉携带与母亲相同的BRCA1突变；37岁时选择进行乳腺切除术卵巢输卵管切除

遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征朱莉1819遗传性乳腺癌/卵巢癌19遗传性乳腺癌/卵巢癌检测项目检测基因遗传性乳腺癌/卵巢癌检测BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、PALB2、PTEN、TP53、ATM、CHEK2、NBN、STK11、MUTYH、EPCAM、LKB1、RAD51C、RAD51D、RAD50、BLM、FANCC、FANCM基因组合测序20检测结果为阳性的患者患者遗传性乳腺癌相关基因发现明确定义的有害突变，从遗传学角度分析该突变有遗传性。需要一、二、三级家属送样检测。对于患者，可给予针对性的个体化治疗。结果分析21对于阳性患者其目前未发病的亲属如果某位亲属经检测具有此相同基因突变，则该亲属携带有遗传性癌症致病基因，建议采取临床干预手段预防癌症发生。针对乳腺癌检测结果为阳性的干预手段：

1处方药，如他莫昔芬（tamoxifen），以减少患乳腺癌的风险

2口服避孕药降低卵巢癌的风险

3加强早期监视（体检和测试）

4预防手术：双侧乳腺切除术（PCM）和双侧卵巢切除术家属检测结果分析及干预手段22遗传性肿瘤筛查检测项目检测项目检测内容遗传性肿瘤综合检测包含了遗传性乳腺癌、结直肠癌等10余种常见肿瘤相关的79个基因的全外显子检测遗传性乳腺癌/卵巢癌检测BRCA1、BRCA2、PALB2等20个基因全外显子检测遗传性结直肠癌MLH1、MSH2、MLH3等16个基因全外显子检测遗传性胃癌检测CDH1、MET、TP53等14个基因全外显子检测遗传性甲状腺癌检测RET、BMPR1A等29个基因全外显子检测遗传性前列腺癌检测HOXB13、HPC1等8个基因全外显子检测遗传性黑色素瘤检测CDKN2A、CDK4、CDKN1C基因全外显子检测遗传性垂体瘤检测AIP基因多外显子测序遗传性肿瘤患者家属基因验证检测先证者携带有害基因突变的验证检测23早期筛查问题：我现在是否可能有疾病？24肿瘤早期筛查-ctDNA循环肿瘤DNA(CirculatingTumorDNA，ctDNA)在肿瘤形成的超早期，就会出现肿瘤细胞的坏死和凋亡，这些凋亡或坏死的肿瘤细胞会释放其DNA进入外周血形成游离的DNA，因此通过分析循环血液中是否含有肿瘤特异的游离DNA可以达到肿瘤早期筛查的目的。肿瘤游离DNA检测是基于肿瘤共有的常见基因突变位点所设计的检测方法，其阳性结果可以提示被检者体内有肿瘤病灶正在启动形成，但并不能准确的指示病灶形成的位置25微滴式数字PCR（ddPCR）真正意义上的痕量肿瘤突变DNA检测！真正意义上的检测高灵敏度！真正意义上的高端预知肿瘤分子检测工具！26肿瘤早期筛查ddPCR检测癌基因名称检测位点BRAFV600EEGFRL858R,L861Q等24种KRASG12D,G12A,G12V,G12C,G12R,G12S,G13D,G13C,A146THRASG12VIDHR132H,R132C,R132S,R132G,R132L，R172G,R172K,R172MPIK3CAE545K,E545A,H1047R,H1047LRETC634S,C634G,C634R,C634Y,C634P,C634S,C634W,M918TPTENR233*C-KITAla502_Tyr503dup，557/558delSMAD4R361C,R361S,R361HHER2L755S,L755P12个癌基因约60余个突变位点27检测项目检测位点肝癌超早期基因筛查PTEN、TP53基因肺癌超早期基因筛查BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA、RET、PTEN、TP53基因胃癌超早期基因筛查KRAS、HRAS、C-kit、TP53基因胰腺癌超早期基因筛查EGFR、KRAS、TP53、BRAF基因甲状腺癌超早期基因筛查BRAF、RET、TP53基因结直肠癌超早期基因筛查BRAF、KRAS、PIK3CA、PTEN、SMAD4、TP53基因食管癌超早期基因筛查EGFR、KRAS、HRAS、PTEN、TP53基因乳腺癌超早期基因筛查PIK3CA、PTEN、HER2、TP53基因卵巢癌超早期基因筛查BRAF、KRAS、PIK3CA、PTEN、TP53基因前列腺癌超早期基因筛查PTEN、TP53基因肾癌超早期基因筛查NRAS、KRAS、TP53基因宫颈癌超早期基因筛查KRAS、HRAS、TP53基因膀胱癌超早期基因筛查KRAS、HRAS、TP53基因脑胶质瘤超早期基因筛查IDH、TP53基因恶性黑色素瘤超早期基因筛查BRAF、C-kit基因15种常见恶性肿瘤超早期基因综合筛查BRAF、KRAS、PIK3CA、PTEN、SMAD4、TP53、EGFR、RET、NRAS、IDH、HER2基因15种常见肿瘤

12个癌基因28辅助诊断

29FISH或荧光定量PCR检测在淋巴瘤的应用淋巴瘤FISH检测基因临床应用备注说明套细胞淋巴瘤IGH/CCND1融合基因辅助诊断滤泡性淋巴瘤BCL2/IGH融合基因辅助诊断、判断预后BCL2/IGH重排发生在约80%-85%的FL患者中，检测BCL2/IGH基因重排可以辅助诊断FL。BCL2/IGH阴性的FL患者3年生存率为100%，而阳性者只有54%；阴性者3年疾病无进展为87.5%，而阳性者只有13%。弥漫性大B细胞淋巴瘤BCL6基因断裂重组辅助诊断、判断预后目前研究确定至少40%的DLBCL涉及BCL6基因重排。BCL6阳性患者诊断治疗36个月后，疾病停止发展的比率为82%，携带有BCL6重排的病例预后较好。伯基特淋巴瘤C-MYC基因断裂重组辅助诊断约80%的伯基特淋巴瘤病例发生t(8；14)（q24;q32）；约15%的伯基特淋巴瘤病例发生t(2；8)(p11;q24)；约5%发生t(8；22)（q24;q11）。粘膜相关淋巴组织淋巴瘤MALTI基因断裂辅助诊断胃MALT淋巴瘤与幽门螺旋杆菌（HP）感染导致的慢性胃炎有关，MALT1/API2融合基因阴性的患者抗HP治疗有效，阳性患者抗HP治疗无效。胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤API2-MALTI融合基因指导治疗30用药指导问题：最适合我的治疗是什么？31NCCN指导目录经验用药常规选择化疗药物途径低毒，低副作用毒性较强、副作用明显恶性肿瘤的主要治疗手段缓解诱导巩固或维持治疗辅助治疗3233药物敏感性检测药物代谢毒性检测个体差异个体化用药33个体化用药的必要性遗传变异是药物个体差异的基础

基因涉及：药物代谢酶、膜转运蛋白、靶向药物治疗靶点相关基因规范：结合分子检测，进一步筛选适合该患者的化疗方案预测药物敏感性提示选用的药物剂量防止病人服用会对该病人产生极大毒副作用的药物肿瘤异质性34ERCC1表达量高低铂类药物XRRM1表达量高低铂类药物RRM1表达量高低紫杉醇类诺维本紫杉醇类吉西他滨紫杉醇类铂类铂类吉西他滨+++ERCC1

表达量高低RRM1表达量高低√RRM1表达量高低++正确的时间正确的病人正确的治疗药物遗传学/药物基因组学：化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效应与特定的一种（一组）基因的表达和/或多态性显著相关。相关基因的检测，预测化疗药物的疗效，选择合适的药物进行个体化化疗，已经成为提高疗效、减少无效治疗的合理选择。35铂类相关靶点检测检测靶标检测依据ERCC1NCCN指南表明：ERCC1低表达的NSCLC患者使用铂类药物效果明显优于ERCC1高表达患者。BRCA1临床研究表明BRCA1mRNA低表达提示患者对药物敏感，生存期明显延长XRCC1(2项)临床研究表明XRCC1基因与铂类药物疗效相关GSTP1临床研究表明GSTP1-Exon5突变的患者对铂类药物敏感MRP2临床研究表明MRP2-Exon10（G1249A）突变增加肿瘤患者对铂类药物的敏感性NSCLC用药指导一、二线药物KawashimaA,TakayamaH,KawamuraN,eta1.OncolLett.2012Jul;4(1):15-21.AlshalalfaM,BismarTA,AlhajjR.AdvBioinformatics.2012;2012:373506.361.ERCC1，BRCA1；mRNA表达水平低的患者对铂类药物（如顺铂）敏感，对抗微管类药物（如紫杉醇）耐药。2.TSmRNA或者TS蛋白的表达与5-Fu化疗的敏感性有关3.TUBB3mRNA表达水平与抗微管类药物的疗效密切相关。低表达的患者接受紫杉醇类或长春碱类药物化疗效果较好4.TOP2AmRNA表达水平，TOP2A酶活性的降低或表达水平降低都会造成依托泊苷耐药5.RRM1高表达，吉西他滨药物治疗的疗效较差，使用吉西他滨治疗后生存期相对较短6.CYP2C9*3；基因多态性，与抗癌药物环磷酰胺、异环磷酰胺、依托泊苷和他莫昔芬的代谢相关37化疗药敏:TaqMAN-ARMSARMS(amplificationrefractorymutationsystem):通过设计与突变DNA互补引物，唯有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。技术特点：灵敏度高（灵敏度达0.1%，是传统测序方法200倍）操作简单可重复性强38化疗前评估肿瘤药物对癌细胞的杀伤作用--敏感或耐药程度药物开发过程中化合物的生物活性评价—体外细胞培养技术ATP肿瘤抗癌药物敏感性检测(ATP-TCA)原代肿瘤细胞+化疗药物共培养化疗药敏：ATP-TCA技术39肿瘤细胞化疗药物敏感试验（CD-DST法）化疗药敏（CD-DST法）40乳腺癌结直肠癌胃腺癌肺SCC/Adeno/SCLC成神经细胞瘤黑色素瘤骨髓瘤卵巢癌胰腺癌甲状腺癌食道癌肉瘤肿瘤类型(已验证适用)适用样品类型病理确认含有肿瘤细胞的离体标本：手术样本胸水腹水良好的针刺活检良好的针刺吸取物41靶向治疗42没有相关靶标的患者接受靶向治疗---弊大于利一项覆盖了9个国家和地区，1217例病人的泛亚洲科研显示：没有相关靶标的患者接受了靶向治疗，死亡风险将增加185%——新英格兰医学杂志.2009.9.v361(10).432014年NCCN指南治疗方案（肺癌）确定组织学亚型EGFR突变阳性非鳞状细胞癌（腺癌，大细胞癌，未分类NSCLC）鳞状细胞癌ALK阳性EGFR突变阴性和ALK阴性或未知EGFR突变检测ALK检测EGFR突变检测ALK检测NSCLC用药指导442014年NCCN指南治疗方案一线化疗前发现EGFR突变一线化疗期间发现EGFR突变厄洛替尼/阿法替尼有症状的进展一线治疗EGFR突变阳性的非鳞状细胞癌中断或完成既定的化疗方案，开始或增加厄洛替尼/阿法替尼无症状的进展继续应用厄洛替尼/阿法替尼二线治疗脑全身多发病变孤立病变局部治疗并继续应用厄洛替尼/阿法替尼全脑治疗并继续应用厄洛替尼/阿法替尼局部治疗并继续应用厄洛替尼/阿法替尼含铂两药±贝伐珠单抗±厄洛替尼孤立病变多发病变NSCLC用药指导452014年NCCN指南治疗方案一线化疗前发现ALK突变一线化疗期间发现ALK突变克唑替尼有症状的进展一线治疗ALK突变阳性的非鳞状细胞癌中断或完成既定的化疗方案，开始克唑替尼无症状的进展继续应用克唑替尼二线治疗脑全身多发病变孤立病变局部治疗并继续应用克唑替尼全脑治疗并继续应用克唑替尼局部治疗并继续应用克唑替尼克唑替尼±贝伐珠单抗孤立病变多发病变NSCLC用药指导46Kras突变的肺癌靶向治疗方案阿法替尼EGFR/HER2酪氨酸激酶小分子不可逆抑制剂FDA认证适用于TKI抑制剂治疗失败的患者临床数据：LUX-lung－EGFR突变患有效率90%克唑替尼crizotinibEML4-ALK融合基因具有致癌活性2011年FDA批准，抑制ALK激酶发挥作用带ALK基因NSCLC患者有效率90%适用于局部晚期或转移的NSCLC司美替尼SelumetinibKRAS信号传导通路下游MEK1/2靶点的药物晚期非小细胞肺癌有效，尤其是缓解率高达37%NSCLC用药指导47KohnoT,etal.NatMed.2012;18(3):375-7.NSCLC少见的融合基因类型TakeuchiK,etal.NatMed.2012;18(3):378-81.1、ROS1融合基因5种类型占比1-2%索坦有效2、RET融合基因2种类型占比1%索坦有效3、MPRIP-NTRK1/CD74-NTRK1罕见48化疗药物顺铂ERCC1;BRCA1mRNA表达水平

XRCC1(2项);ERCC1;ERCC2;GSTP1;GSTM1;MRP2基因多态性卡铂紫杉醇TUBB3;STMN1;TaumRNA表达水平

CYP2C8*3;GSTP1;GSTM1;GSTT1基因多态性

多西他赛长春瑞滨长春花碱培美曲塞TSmRNA表达水平；DPYD基因多态性吉西他滨RRM1mRNA表达水平；RRM1;CDA基因多态性依托泊苷（VP16）TOP2AmRNA表达水平；CYP3A4*4;MDR1基因多态性伊立替康UGT1A1*6;UGT1A1*28基因多态性

丝裂霉素NQO1基因多态性异环磷酰胺CYP2C9*3基因多态性靶向药物贝伐珠单抗VEGFRmRNA表达水平厄洛替尼；吉非替尼EGFR(Exon18/19/20/21);K-ras(2项);B-raf基因突变西妥昔单抗尼妥珠单抗K-ras(2项);B-raf;PIK3CA(2项)基因突变；EGFRmRNA表达水平EGFRmRNA表达水平帕尼单抗；埃克替尼舒尼替尼VEGFR;PDGFRβmRNA表达水平；C-kit(4项);PDGFRα(2项)基因多态性索拉非尼PDGFRβ;VEGFRmRNA表达水平

克唑替尼c-METmRNA表达水平

ROS1;EML4-ALK融合基因非小细胞肺癌个体化诊治检测系统化方案49PinoMS,etal.Gastroenterology.2010Jun;138(6):2059-72.结直肠癌分子模型K-RAS突变在结直肠癌是早期的分子事件50K-ras突变：1、K-rasExon12、13密码子突变用爱必妥无效2、原发灶和继发灶的样本都可以用作检测3、B-raf突变(V600E)预后较差、爱必妥治疗效果不好MSI1、50岁以下的结肠癌患者推荐做MMR错配基因突变检测2、MSI-HLynch综合征风险增加3、指导肠癌的化疗51Lynch的意义应更早给予更密集的结肠镜检查

对未发生结肠癌的基因突变携带者，应从20岁～25岁起（或在家族中最早确诊结肠癌者诊断年龄前10年）进行结肠镜检查，每1～2年1次，35岁后每年1次，并切除检查中发现的结肠腺瘤，可有效的预防结直肠癌。对于女性先证者或亲属，可能还要考虑进一步监测子宫内膜癌危险

每年接受一次妇科检查、经阴道超声检查和血清CA125水平检查，以预防子宫内膜癌和卵巢癌

5253结直肠癌个体化诊疗检测系统方案

药物靶标指标适用样本适用技术奥沙利铂顺铂ERCC1XRCC1GSTP1

SNP全血（抗凝）/口腔粘膜细胞/各种组织Lunaprobe探针+qPCRERCC1

BRCA1mRNA表达

手术/穿刺样本/全血（抗凝）荧光定量PCR氟尿嘧啶类（5-FU，

卡培他滨）TYMSMTHFRSNP全血（抗凝）/口腔粘膜细胞/各种组织Lunaprobe探针+qPCRDPD

西妥昔单抗

帕尼单抗EGFR

KRAS

体细胞突变手术/穿刺样本

/胸水/血清或血浆qPCR+HRMEGFRmRNA表达手术/穿刺样本/全血（抗凝）荧光定量PCR

伊立替康UGT1A1多态性（SNP）全血（抗凝）/口腔粘膜细胞/各种组织Lunaprobe探针+qPCR54胃癌个体化诊疗检测系统方案

药物靶标指标适用样本适用技术

卡铂ERCC1

BRCA1

mRNA表达水平

手术/穿刺样本/全血（抗凝）荧光定量PCR

顺铂紫杉醇TUBB3

STMN多西紫杉醇

培美曲赛TYMS

吉西他滨RRM1

依托泊苷TOP2A

曲妥珠单抗（Herceptin）HER2基因扩增手术/穿刺组织FISHHER2蛋白表达IHC

伊立替康

UGT1A1多态性（SNP）全血/口腔粘膜细胞Lunaprobe探针+qPCR55肝癌个体化诊疗检测系统方案

药物靶标指标适用样本适用技术顺铂ERCC1

BRCA1

mRNA表达水平

手术/穿刺样本/全血（抗凝）荧光定量PCR奥沙利铂5-FUTYMS

卡培他滨

索拉菲尼PDGFRAEGFR吉西他滨RRM156胰腺癌个体化诊疗检测系统方案

药物靶标指标适用样本适用技术顺铂ERCC1

BRCA1

mRNA表达水平

手术/穿刺样本/全血（抗凝）荧光定量PCR奥沙利铂5-FUTYMS

卡培他滨

厄洛替尼EGFREGFRKRAS体细胞突变手术/穿刺样本/血清或血浆qPCR+HRM吉西他滨RRM1mRNA表达水平手术/穿刺样本/全血（抗凝）荧光定量PCR0FISH+–可接受赫赛汀治疗可接受赫赛汀胃癌治疗的欧盟标准1+2+3+IHC肿瘤标本HerceptinEUSmPC:.57CKIT+PDGFRA检测与胃肠间质瘤GIST：由突变的C-kit或PDGFRa驱动；组织学上多由梭形细胞、上皮样细胞、偶或多形性细胞，排列成束状或弥漫状图像，免疫组化检测通常为CD117或DOG-1表达阳性。58推荐存在以下情况时，应该进行基因学分析(1)对疑难病例应进行c-kit或PDGFRA突变分析，以明确GIST的诊断；(2)术前拟用分子靶向治疗者；(3)所有初次诊断的复发和转移性GIST，拟行分子靶向治疗；(4)原发可切除GIST手术后，中-高度复发风险，拟行伊马替尼辅助治疗；(5)鉴别NF1型GIST、完全性或不完全性Carney’s三联征、家族性GIST以及儿童GIST；(6)鉴别同时性和异时性多原发GIST；(7)继发性耐药需要重新检测。中国胃肠间质瘤诊断治疗共识(2013年版)59治疗过程中是否受益？是否有转移、复发？肿瘤疗效、转移复发监控循环肿瘤细胞（CTC）601869年AustMedJ，Ashworth最早在转移性癌症患者血液中观察到。2005年NEnglJMed，Cristofanilli证实治疗前CTC数目是转移性乳腺癌患者无进展生存期和总生存期的独立预测因子。循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞（CTC）原发肿瘤血管生成浸润侵入血管内侵入血管外

(CTC)血管内增殖

(CTM)转移转移播散肿瘤细胞（DTC）微转移休眠灶循环肿瘤细胞（CTC）循环肿瘤

微栓（CTM）凋亡的CTC浸润肿瘤细胞

扩增血管生成上皮－间质转化（EMT）间质－上皮转化（MET）转移到骨髓和其他器官61化疗前后CTC的数量变化反映临床疗效：化疗后CTC数量减少患者的临床疗效好于CTC数量增加的患者

CTC在区分良恶性肿瘤中作用：在30.6%的原发性肺癌患者能检测到CTC。CTC在肺癌患者中的计数显著高于非恶性疾病患者

CTC在判断是否存在转移中有重要参考价值：对于原发性肺癌患者，CTC计数在有远处转移的肺癌患者中有显著升高

62CTC检测方案举例手术效果评估手术前CTC，术后三天CTC，术后三周CTC放/化疗效果实时监测放/化疗前CTC，一个月CTC，三个月CTC术后复查（年检），CTC检测6364强生CellSearch系统FDA和CFDA认证的循环肿瘤细胞监测仪64结合FISH技术，大大提高检出率获取活细胞，后续研究CellSearch系统iFISH-CTC技术血源细胞肿瘤细胞免疫磁珠

CK+CD45--DAPI+免疫染色免疫染色+FISH

FISH

CK+CD45--DAPI+富集非血源性肿瘤细胞的目的个性化添加新的肿瘤标志物阴性富集CTC结合FISH检测技术优势65外周血循环肿瘤细胞检测循环肿瘤细胞CTC阴性富集：广泛适用性不依赖肿瘤细胞标示物通用于所有实体肿瘤适用于所有非血源性循环稀有细胞的富集适用于多标本来源：血液、胸腹水等富集后的细胞处于自然状态，便于进行一系列后续检测1针对不同癌种，特异性探针组合、探针-蛋白组合，提高灵敏性引入CD45染色，排除血源性异常细胞干扰，提高特异性以FISH技术为平台，基因、蛋白水平多重检测：细胞鉴别、计数和分子分型及细胞表型分析蛋白联合核酸，细胞形态与遗传信息改变明了66分子病理学检测标本的要求合格的标本是分子病理检测的首要条件组织形态保持完整，细胞结构清晰满足检测方法所需的细胞质量和数量所含生物分子结构和数量达到检测要求67标本类型新鲜组织：手术切除组织，穿刺组织，内窥镜活检组织。石蜡包埋标本是分子病理检测主要标本：手术切除组织，穿刺组织，内窥镜活检组织细胞学标本：胸腹水、冲洗液和痰液等血液标本：血清、血浆、循环全血。68标本处理----固定对病理分析有很大的影响，特别是免疫组化和分子病理检测。需要病理医生，临床医生和手术室护士的密切配合。固定液：10%中性福尔马林液固定液容量：固定组织的3-5倍，至少浸没整个标本固定组织：大标本需要切开固定固定开始时间：组织离体0.5h之内。固定时长：小组织一般固定6～12h，较大的标本需固定6～48h。69标本固定对DNA影响70基因芯片荧光原位杂交（FISH）基因测序PCR检测荧光定量PCR分子病理检测平台71Real-TimePCR即实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。72高通量测序平台IlluminaHiseq新一代测序系统

IonPGM

新一代测序系统IonProton

新一代测序系统73第一代测序技术：双脱氧链终止法，即Sanger测序，利用DNA聚合酶及双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列的方法。通量低，不能满足大规模检测基因的要求第二代测序技术（新一代测序，NGS）：在芯片上扩增形成簇，从系列图像中读取每一点的碱基序列。高通量，速度快，，直接通过聚合酶或连接酶进行体外测序合成，测序仪能检测稀有基因突变领域。包含全基因组测序、外显子组测序及目标测序74人乳头瘤病毒（HPV）基因分型检测

——子宫颈癌早期筛查采用基因芯片检测技术，利用微量点样，将26种HPV型特异性探针点样于基因芯片基质上，制成基因芯片；经过对样本中的DNA进行PCR扩增、杂交和显色，最后通过HPV分型基因芯片检测阅读系统自动采集图像并分析和报告检测结果，可一次性检测26种HPV亚型。具体检测流程：宫颈刷取样—DNA提取—PCR扩增—杂交—显色—扫描分析，整个流程操作约需5.5小时。75序号FISH

项目名称项目内涵1HER-2基因荧光原位杂交（FISH）检测为乳腺癌、胃癌等肿瘤患者使用靶向治疗药物（赫赛汀）提供用药参考2TOPO2A基因荧光原位杂交（FISH）检测评估乳腺癌预后；乳腺癌蒽环类药物化疗方案用药指导3EGFR扩增基因荧光原位杂交（FISH）检测非小细胞肺癌TKI靶向药物用药指导4ALK基因荧光原位杂交（FISH）检测辅助诊断渐变性大细胞淋巴瘤；非小细胞肺癌靶向药物用药指导5C-MET扩增基因荧光原位杂交（FISH）检测非小细胞肺癌TKI靶向药物用药指导6PTEN基因荧光原位杂交（FISH）检测评估肺癌的恶性程度与预后7N-myc基因荧光原位杂交（FISH）检测神经母细胞瘤预后判断81p、19q缺失基因荧光原位杂交（FISH）检测少突胶质细胞瘤临床治疗指导和预后判断9SYT基因荧光原位杂交（FISH）检测辅助诊断滑膜肉瘤10EWSR1基因荧光原位杂交（FISH）检测辅助诊断尤文氏肉瘤11PAX3-FKHR基因荧光原位杂交（FISH）检测辅助诊断腺泡状横纹肌肉瘤12TMPRSS2-ETS基因荧光原位杂交（FISH）检测辅助临床早期诊断前列腺癌76序号项目名称项目内涵13IGH/BCL2基因荧光原位杂交（FISH）检测辅助诊断滤泡性淋巴细胞瘤14IGH/c-myc基因荧光原位杂交（FISH）检测辅助诊断伯基特淋巴瘤15IGH/CCND1基因荧光原位杂交（FISH）检测辅助诊断套细胞淋巴瘤16AP12/MALT1基因荧光原位杂交（FISH）检测指导针对胃MALT淋巴瘤患者的抗幽门螺旋杆菌治疗17IGH/MALT1基因荧光原位杂交（FISH）检测辅助诊断粘膜相关淋巴组织淋巴瘤18BCL6基因荧光原位杂交（FISH）检测辅助诊断弥漫性大B细胞淋巴瘤193、7、16p、17染色体基因荧光原位杂交（FISH）检测无创的泌尿系统移行上皮癌早期诊断；泌尿系统肿瘤术后复发监测20hTERC扩增基因荧光原位杂交（FISH）检测区分ASC-US/CINⅠ和CINⅡ/CINⅢ,明确病理分级，指导治疗方案选择；TERC基因扩增者，向宫颈癌发展风险高于50%，宜采取积极治疗方式。21EGFR基因突变检测非小细胞肺癌TKI靶向药物用药指导22KRAS&BRAF基因突变检测非小细胞肺癌、结直肠癌TKI靶向药物用药指导23KRAS基因突变检测非小细胞肺癌、结直肠癌TKI靶向药物用药指导24BRAF基因突变检测甲状腺癌、黑色素瘤等靶向药物的用药指导77序号项目名称项目内涵25C-KIT&PDGFRA基因突变检测胃肠间质瘤靶向药物用药指导26PIK3CA非小细胞肺癌靶向药物用药指导27BRCA1&BRCA2评估患者患遗传性乳腺癌或卵巢癌的风险28结直肠癌MSI评估结直肠癌患者预后，并预测5-FU类化疗药物的疗效29淋巴瘤基因重排辅助诊断淋巴瘤30UGT1A1基因多态性指导化疗药物伊立替康的临床使用31XRCC1基因多态性指导铂类化疗药物的临床使用32TYMS基因多态性指导氟类化疗药物的临床使用33TMPT基因多态性指导巯嘌呤类药物的临床使用34CYP2D6基因多态性指导他莫昔芬在乳腺癌治疗中的临床使用35肿瘤细胞化疗药物敏感试验评估化疗药物敏感性与耐药性78膀胱癌的临床分期可分为表浅性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌两大类。膀胱癌分期肌层浸润性膀胱癌(占15%-25%)表浅性膀胱癌（占75%-85%）T2-T4Tis（约占10%）Ta（约占70%）T1（约占20%）FISH检测膀胱癌79膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，是世界十大恶性肿瘤之一，我国男性膀胱癌发病率位居泌尿生殖系恶性肿瘤发病率第一位，居全身肿瘤的第八位，女性排在第十二位以后。膀胱癌中大约90%为尿路上皮细胞癌（TCC），10%的为鳞状上皮细胞癌或者腺癌。75%的膀胱癌是“浅表性的”（也就是pTa、pT1或是pTIS），其中的50%-80%的患者可能会一次或者多次复发，15-25%的患者将发展成为侵袭性肿瘤。

“浅表性”膀胱癌的患者应该经常接受膀胱镜以及脱落细胞学检查来监测肿瘤复发和进展。概要80膀胱镜检查和脱落细胞学检查也是对40岁以上并出现血尿的患者的常规检查项目。然而大量的研究证明，脱落细胞学对于膀胱癌检测的灵敏度非常低，膀胱癌检验方法亟待提高。最新研究表明，能够特定检测染色体数目变化及基因位点缺失情况的荧光原位杂交（FISH）技术很好地填补了常规方法的不足，与常规方法相结合大大提高了膀胱癌的诊断水平。概要8182

膀胱癌中几乎所有的染色体都可能发生数目和结构的畸变，只是某些染色体的变化较其它染色体更为常见，如1、3、4、7、8、9、10、11、12、13、17、18和20号染色体，其中又以9号染色体的改变最为多见9号染色体或其部分区域的缺失是最常见的遗传变异。9p21(P16)缺失是尿路上皮癌早期最常见的改变之一Veeramachaneni等对121例膀胱癌进行了研究，3号染色体多倍体高达76%。7号染色体多倍体发生率大约为13.0%-76.2%。7号染色体多倍体与膀胱癌的分级、分期正相关。17号染色体多倍体发生率大约为12%-47%，其多倍体与分期、分级显著相关。分子基础82尿路上皮癌的早期诊断

细胞遗传学改变通常早于细胞形态学变化。甚至有报导部分初次膀胱镜活检未发现病变而FISH检测结果为阳性的病例，在12个月内再次活检时发现了膀胱尿路上皮癌。尿路上皮癌的复发检测

文献报道FISH结果阳性的膀胱癌患者在两年内复发的比例明显高于FISH结果阴性的膀胱癌患者（P＜0.05）。辅助鉴别诊断肾盂尿路上皮癌和肾细胞癌

肾盂被覆尿路上皮，其癌变也会发生相应四个指标的异常，因此对于肾盂癌和肾癌难以鉴别情况下，应用FISH技术可以简便的进行鉴别诊断以及确认肿瘤来源。临床价值83膀胱癌患者-FISH阳性

（杂I区：3,7,17号染色体非整倍体；杂II区：p16基因缺失）杂I区杂II区3（绿）；7（青）；17（红）

3（绿）；p16（红）84正常人尿脱落细胞-FISH阴性

（3,7,17号染色体整倍体、p16基因正常）杂I区杂II区853，7，17号染色体着丝粒探针和9p21区带探针包含了膀胱癌中出现频率最高的染色体变异。用于血尿病人中膀胱癌早期诊断以及膀胱癌术后复发的一项辅助检测手段。研究表明，9号染色体部分或全部丢失在50%膀胱癌患者中有发生，与复发相关。3号染色体多倍体发生率约76%，与复发有关。7号染色体多倍体发生率约13%～76%，与分期分级相关，可预测肿瘤的浸润性。17号染色体多倍体发生率12%～47%，与分期分级显著相关。检验结果的解释

晨尿200ML（夜起尿分开收集），要求在2个小时内处理86检测出了XX癌症化疗放疗靶向药物CTC循环肿瘤细胞化疗药物的敏感性检测化疗药物的毒副作用检测放疗的敏感性检测放疗的毒副作用检测对药物敏感：建议使用该药物对药物不敏感：建议换用其他药物对药物毒副作用耐受高：建议使用该药物对药物毒副作用耐受低：建议换其他药物对放疗敏感：建议使用放疗对放疗不敏感：建议不使用放疗对放疗毒副作用耐受高：建议使用放疗放疗毒副作用耐受低：建议不使用放疗手术、放疗或化疗后进行循环肿瘤细胞的监测建议使用靶向药建议不使用靶向药肿瘤治疗过程分子学应用87肿瘤分子分型88肿瘤分子分型（Molecularclassification）89定义：通过综合的分子遗传学分析，为疾病分类提供更多的生物学信息，从而使疾病分类的基础从宏观形态学转向以分子病理特征为主要依据的新分类体系（molecularpathologycharacteristics-basedclassification）1999年由美国国立癌症研究所率先提出

最早于2000年在乳腺癌中得到很好应用肿瘤分子分型的意义90肿瘤异质性的分子表现

从分子水平解释了肿瘤临床生物学行为、预后及疗效的差异性

更好地预测肿瘤复发、转移及预后

为肿瘤个体化治疗提供直接依据2013年StGallen国际乳腺大会乳腺癌分子分型与全身辅助治疗专家共识分子分型临床病理学替代指标定义治疗原则腔面A型同时满足：ER和PR+，HER2–,Ki67低表达，多基因表达检测结果为低复发风险（如果多基因表达检测可行）内分泌治疗效果最佳，通常仅需内分泌治疗腔面B型腔面B型（HER2–）：ER+,HER2–,且至少满足以下一条：Ki67高表达、PR-或低表达、多基因表达检测结果为高复发风险（如果多基因表达检测可行）全部患者均需内分泌治疗，大部分患者需要加用化疗腔面B型（HER2+）：ER+,HER2过表达或基因扩增,任何状态Ki67、任何状态PR化疗+抗HER2治疗+内分泌治疗HER2过表达型HER2+(非腔面型）：HER2过表达或基因扩增,

ER和PR-化疗+抗HER2治疗基底细胞样型三阴性（导管癌）:ER和PR-,HER2–化疗，三阴性还包括某些特殊组织学类型：内分泌反应型（筛状癌、小管癌和黏液癌），推荐内分泌治疗。内分泌无反应型（大汗腺癌、髓样癌、腺样囊性癌和化生性癌），推荐化疗91乳腺癌21基因检测内容及结果

21基因检测的基因分为6组：1.增殖组：BIRC5（Survivin)、MKI67、MYBL2、CCNB1(CyclinB1)、STK152、侵袭组：CTSL2(CathepsinL2)、MMP11(Stromelysin3)3、HER2组：GRB7、HER24、雌激素组(ER组）：ESR1、PGR、BCL2、SCUBE25、其他基因组：CD68、GSTM1、BAG16、参照基因组：ACTB（Beta-actin)、GAPDH、RPLPO、GUSB、TFRC

得到结果：ER评分，PR评分，HER2评分得到阴阳性结果。复发风险评分（RS），10年复发风险检测结果为“复发风险评分”，分值为0-100分。<18分为复发低危；18-30为复发中危；>31为复发高危。复发高危的患者采用辅助性化疗更有效。判读标