《血红蛋白的提取和分离》试题库2

《血红蛋白的提取和分离》试题库题组11.使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程,可表示为图中()解析:本题考查对凝胶色谱法分离蛋白质原理的理解,相对分子质量较大的蛋白质留在颗粒外面,相对分子质量较小的蛋白质进入颗粒内部;相对分子质量大的蛋白质通过凝胶间隙先被洗脱,相对分子质量小的蛋白质进入凝胶内部而后被洗脱。答案:B2.蛋白质提取和分离分为哪几步?()A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定解析:A中凝胶色谱操作及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。答案:C3.在血红蛋白的整个提取过程中,不断用磷酸缓冲液处理的目的是()A.防止血红蛋白被氧化B.血红蛋白是一种两性物质,需要酸中和C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内,维持其结构和功能解析:利用磷酸缓冲液模拟细胞内的pH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于分离观察(红色)和研究(活性)。答案:D4.将人红细胞置于盛有下列液体的离心管中,10min后离心,得到沉淀物和上清液,则上清液中K+含量最高的离心管内盛有()A.质量分数为10%的氯化钠溶液B.质量分数为20%的蔗糖溶液C.质量分数为%的氯化钠溶液D.蒸馏水解析:红细胞在蒸馏水中渗透吸水涨破,所以细胞中K+流出,使上清液中K+含量较高。答案:D5.凝胶色谱分离法分离蛋白质时,凝胶的种类较多,但其作用都是()A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B.吸附一部分蛋白质,从而影响蛋白质分子的移动速度C.将酶或细胞固定在凝胶中D.与蛋白质分子进行化学反应,从而影响其移动速度解析:凝胶的种类较多,但每一种凝胶内部都有孔隙。相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量小的容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢;相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。答案:A聚丙烯酰胺凝胶电泳法加入SDS的作用是()A.增大蛋白质的相对分子质量B.改变蛋白质的形状C.掩盖不同种蛋白质间的电荷差别D.减少蛋白质的相对分子质量解析:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所加的SDS可完全掩盖不同种蛋白质间的电荷差。答案:C7.下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品处理步骤的描述,正确的是()A.红细胞的洗涤:加入蒸馏水,缓慢搅拌,低速短时间离心B.血红蛋白的释放:加入生理盐水和甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌C.分离血红蛋白:将搅拌好的混合液离心、过滤后,用分液漏斗分离D.透析:将血红蛋白溶液装入透析袋,置于pH为的磷酸缓冲液中透析12h解析:对红细胞进行洗涤时,应加入生理盐水,防止细胞破裂;将血红蛋白从红细胞中释放时,需要加入蒸馏水,以便使红细胞破裂释放出血红蛋白;透析时,应将透析袋置于pH为的磷酸缓冲液中透析12h。答案:C8.在蛋白质的提取和分离中,关于对样品处理过程的分析无误的是()A.洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B.洗涤时离心速度过小,时间过短,白细胞等会沉淀,达不到分离的效果C.洗涤过程选用质量分数为%的NaCl溶液D.透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质解析:洗涤红细胞的目的是去除血浆中杂蛋白;洗涤时离心速度过大,时间过长,白细胞等会沉淀,达不到分离的效果;洗涤过程选用质量分数为%的NaCl溶液。答案:D9.下列有关透析的叙述,错误的是()A.用于透析的薄膜要具有选择透过性B.透析膜一般是用硝酸纤维素制成的C.透析能使小分子自由进出,而将大分子保留在袋内D.透析可用于更换样品的缓冲液解析:透析袋一般是用硝酸纤维素(又称玻璃纸)制成的,它没有生物活性,故不具有选择透过性(活的生物膜才具有选择透过性)。透析袋能使小分子自由进出,而将大分子保留在袋内。透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液。答案:A10.已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子,其分子大小、所带电荷的性质和数量情况如下图所示,下列有关该样品中蛋白质的分离的叙述,正确的是()A.将样品装入透析袋中透析12h,若分子乙保留在袋内,则分子丙也保留在袋内B.若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质,则分子甲移动速度最快C.若将样品以2000r/min的速度离心10min,分子戊存在于沉淀中,则分子甲也存在于沉淀中D.若用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子,则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最远解析:分子乙留在透析袋内,说明其相对分子质量比较大,分子丙的相对分子质量比分子乙大,所以分子丙也留在袋内;分子甲的相对分子质量最小,进入凝胶内部通道而移动速度慢;分子戊比分子甲的相对分子质量大,分子甲可能不存在于沉淀中;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的样品,其电泳迁移率完全取决于分子的大小,相对分子质量相差越大,形成的电泳带相距越远。答案:A11.在血红蛋白分离过程中,如果红色区带歪曲、散乱、变宽,与其有关的是()A.血红蛋白释放 B.色谱柱的装填C.洗脱过程 D.样品的处理解析:如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话,能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整,随着洗脱液缓慢流出;如果红色区带歪曲、散乱、变宽,说明分离的效果不好,这与凝胶色谱柱的装填有关。答案:B12.下列对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作,不正确的是()A.加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐B.让吸管管口沿管壁环绕移动,贴壁加样至色谱柱顶端,不要破坏凝胶面C.打开下端出口,待样品完全进入凝胶层后,直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱D.待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,每5mL收集一管,连续收集流出液解析:打开下端出口,待样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口,再小心加入适量的20mmol/L的磷酸缓冲液,然后连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱。答案:C13.下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置,请回答下列问题。(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分,其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有功能。(2)甲装置中,B是血红蛋白溶液,则A是;乙装置中,C溶液的作用是。(3)甲装置用于,目的是。用乙装置分离蛋白质的方法叫,是根据分离蛋白质的有效方法。(4)用乙装置分离血红蛋白时,待时,用试管收集流出液,每5mL收集一管,连续收集。解析:血红蛋白具有运输O2和部分CO2的作用。用缓冲液可以保持与体内的pH一致。甲装置中,B是血红蛋白溶液,则A是磷酸缓冲液;乙装置中,C溶液的作用是洗脱血红蛋白。甲装置用于透析(粗分离),目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。用乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法,是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。答案:(1)运输(2)磷酸缓冲液洗脱血红蛋白(3)透析(粗分离)去除样品中相对分子质量较小的杂质凝胶色谱法相对分子质量的大小(4)红色的蛋白质接近色谱柱底端14.血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分,负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。(1)将实验流程补充完整:A为,B为。(2)洗涤红细胞的目的是去除,洗涤次数过少,无法除去;离心速度过高和时间过长会使一同沉淀,达不到分离的效果。洗涤干净的标志是。释放血红蛋白的过程中起作用的是。(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为的目的是。如果红色区带,说明色谱柱制作成功。解析:在蛋白质分离与提取过程中包括样品的处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四步,每一步均应用了不同的操作技术。答案:(1)血红蛋白的释放样品的加入和洗脱(2)杂蛋白(血浆蛋白)血浆蛋白白细胞和淋巴细胞离心后的上清液中没有黄色蒸馏水和甲苯(3)准确模拟生物体内的生理环境,保持体外的pH和体内一致均匀一致地移动15.某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中,准备从猪的血液中初步提取血红蛋白,设计的“血红蛋白提取、分离流程图”如下。实验准备(配制缓冲液、血细胞悬液)样品处理(洗涤、破碎、离心等)蛋白质粗分离(透析)纯化、纯度鉴定(凝胶色谱法、电泳等)请回答下列有关问题。(1)样品处理中红细胞的洗涤要用反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH=的缓冲液并充分搅拌,可以破碎红细胞,破碎细胞的原理是

。(2)血红蛋白粗分离阶段,透析的目的是,若要尽快达到理想的透析效果,可以(写出一种方法)。(3)电泳利用了待分离样品中各种分子的等的差异,而产生不同迁移速度,实现各种分子的分离。(4)一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳,观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如图所示。由图可知携带者有种血红蛋白,从分子遗传学的角度作出的解释是

。解析:(1)洗涤红细胞所用的溶液是生理盐水,根据渗透作用原理,将红细胞置于低渗溶液中,红细胞会吸水涨破,释放出血红蛋白。(2)血红蛋白粗分离阶段,透析的目的是除去样品中的小分子杂质。可通过增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法缩短透析时间,尽快达到理想的透析效果。(3)由于各种分子带电性质以及分子大小、形状等的差异,在电泳过程中会产生不同的迁移速度,从而实现各种分子的分离。(4)根据图示可知,镰刀型细胞贫血症的携带者含有两种血红蛋白,原因是携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因,可以控制合成两种不同的蛋白质。答案:(1)生理盐水渗透原理(当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时,细胞吸水涨破)(2)除去小分子杂质增加缓冲液的量或及时更换缓冲液(3)带电性质以及分子大小、形状(4)2携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因,可以控制合成两种不同的蛋白质题组21．蛋白质的分离方法——凝胶色谱法凝胶色谱法也称做________________，是根据________________的大小分离________的有效方法。相对分子质量直径大小运动方式运动速度运动路程洗脱次序大____凝胶颗粒空隙直径，被排阻在____垂直向下移动____较短先从凝胶柱洗脱出来小____凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部垂直向下移动，无规则扩散进入凝胶颗粒____较长后从凝胶柱洗脱出来2.缓冲液的作用和组成(1)作用在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界________和________对溶液________的影响，维持pH基本不变。纯水的pH因加入少量的强酸或强碱而发生很大变化。然而，1滴浓盐酸加入到1LCH3COOH—CH3COONa混合溶液或NaH2PO4—Na2HPO4混合溶液中，[H＋]的增加不到百分之一(从×10－7mol/L增到×10－7mol/L)，pH没有明显变化。(2)组成缓冲溶液通常由________种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的____________就可以制得________________________的缓冲液，其类型主要有3种：①弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。②多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。③弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。3．电泳(1)概念电泳是指____________在________的作用下发生________的过程。许多重要的生物大分子，如________、________等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上________或________。在电场的作用下，这些带电分子会向着________________的电极移动。(2)原理在同一电场下，由于各种分子________性质的差异及分子本身________、______的不同，使带电分子产生________________，从而实现样品中各种分子的分离。(3)常用方法①____________电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大小和形状不同而不同，从而得以分离。②________________电泳加入SDS作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；与各种蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。1．红细胞的洗涤(1)目的：____________，以利于后续步骤的分离纯化。(2)过程eq\x(①采集血样)：为防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血剂柠檬酸钠eq\x(②低速短时)：500r/min，离心2min，这样做的目的是防止红细胞与白细胞一同沉淀，达不到分离效果eq\x(③吸去)：用胶头吸管吸去上层黄色血浆eq\x(④生理盐水)：向盛有暗红色红细胞液体的烧杯中加入五倍体积的生理盐水，缓缓搅拌10mineq\x(⑤低速短时离心)eq\x(⑥重复③④步骤三次)：直至上清液中没有黄色，表明红细胞已经洗涤干净，否则需重复洗涤(3)操作提示：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要，洗涤次数少，无法除去血浆蛋白，离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果。2．血红蛋白的____(1)方法：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加______到原血液的体积，再加40%体积的______，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。(2)目的：使红细胞吸水____，血红蛋白释放出来。(3)原理：渗透作用。3．分离血红蛋白溶液(1)方法①将搅拌好的混合液转移到__________中，以2000r/min的速度____10min。②将离心管中的液体部分用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。③将滤液置于分液漏斗中，静止片刻后，分出下层的红色透明液体，即为血红蛋白溶液。(2)目的：使________与大部分杂质分离开，便于后续纯化。(3)离心后试管中的溶液分为4层，最上面的一层是甲苯层，第二层是脂溶性物质沉淀层，第三层是血红蛋白水溶液层，最下层是杂质沉淀层。4．粗分离——透析(1)原理：______能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。(2)过程：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为，透析12h。(3)目的①除去样品中相对分子质量较小的杂质。②用于更换样品的缓冲液。1．凝胶色谱柱的制作(1)取长40cm，内径为1.6cm的________，两端需用砂纸磨平。(2)柱底部制作：打孔→挖出________→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将________上部包好。(3)柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。(4)将上述三部分按相应位置组装成一个整体。2．凝胶色谱柱的装填(1)计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量↓(2)凝胶_______：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬液↓(3)________：将色谱柱垂直固定在支架上↓(4)________：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内↓(5)________：用20mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密3．样品的加入和洗脱(1)调整缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，调整缓冲液与凝胶面________(2)________透析样品：关闭下端出口，用吸管小心将1mL样品加到色谱柱顶端(3)样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内(4)再调整________：关闭出口，小心加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度(5)________：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱(6)收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集四、实验操作提示1．红细胞的洗涤：________________________________。2．凝胶的预处理：_________________________________________________________。3．色谱柱的装填：___________________________________________________________。4．色谱柱成功的标志：________________________。五、蛋白质纯度鉴定及实验结果分析与评价1．纯度鉴定——________________________________判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。2．结果分析与评价项目分析血液样品的处理分层____→样品处理完成eq\a\vs4\al(分层不明,显的原因)eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(洗涤次数少，未能除去血浆蛋白,离心速度过高和时间过长))凝胶色谱柱的装填放一个与凝胶柱垂直的日光灯→直接检查；加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整→装填成功血红蛋白的分离血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分离成功1．利用凝胶色谱法分离蛋白质时，蛋白质洗脱出来的顺序是()①相对分子质量最大的②相对分子质量最小的③相对分子质量适中的A．①②③B．③②①C．①③②D．②①③2．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须()A．具有相同的相对分子质量B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子D．具有不同的相对分子质量知识点二分离蛋白质的实验操作3．对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作，不正确的是()A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐B．让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱D．待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5mL收集一管，连续收集流出液4．在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程的分析无误的是()A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果C．洗涤过程选用%的生理盐水D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质1．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷________方向的电极移动()A．相同B．相反C．相对D．相向2．在血红蛋白分离过程中，使用缓冲液的作用是()A．维持溶液浓度不变B．维持溶液酸碱度不变C．催化蛋白质分离过程顺利完成D．无实际意义3．下列有关提取和分离血红蛋白的叙述，错误的是()A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液B．通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化D．可通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度4．凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C．将酶或细胞固定在凝胶中D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度5．下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因()A．分子带电性质的差异 B．分子的大小C．分子的形状 D．分子的变性温度6．下列关于样品的加入和洗脱的叙述，正确的是()A．先加入1mL透析后的样品B．加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出C．如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功D．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水7．凝胶柱制作的顺序一般是()①橡皮打孔②挖凹穴③装玻璃管④盖尼龙网⑤盖尼龙纱⑥将橡皮塞插入玻璃管⑦接尼龙管、装螺旋夹⑧柱顶插入安装玻璃管的橡皮塞A．①③④⑤⑥⑧⑦② B．①②③④⑤⑥⑦⑧C．①②③④⑥⑤⑧⑦ D．①②③⑦⑥⑤⑧④8．凝胶色谱柱制作成功的标志是()A．凝胶装填紧密、均匀B．凝胶色谱柱中有气泡C．洗脱中，红色区带均匀一致移动D．洗脱中，红色区带偏向左边移动9．凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是________，原因________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由__________________________替代。(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)若选用SephadexG－100，则“G”表示_________________________________________，100表示______________。10．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：(1)血红蛋白提取和分离的过程可分为四步：__________、________、________和________。(2)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。①加入柠檬酸钠的目的是____________________________________________________。②以上所述的过程即是样品处理，它包括__________________________、______________、收集血红蛋白溶液。(3)洗涤红细胞的目的是___________________________________________________。(4)你如何知道红细胞已洗涤干净？________________________________________________________________________。(5)分离红细胞时的离心速度及离心时间分别是____________________________________________________________________________。(6)若离心速度过高和时间过长结果会怎样？_________________________________________________________________________________________________________________________________________。(7)将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，即样品的粗分离。①透析的目的是__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________②透析的原理是__________________________________________________________________________________________________________________________________(8)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的是_____________________________________________________________________________________________________________________________知识清单一、1.分配色谱法相对分子质量蛋白质大于外面较快小于较慢2．(1)酸碱pH(2)1～2使用比例在不同pH范围内使用3．(1)带电粒子电场迁移多肽核酸正电负电与其所带电荷相反(2)带电大小形状不同的迁移速度(3)①琼脂糖凝胶②聚丙烯酰胺凝胶二、1.(1)去除杂蛋白(2)②离心③血浆④洗涤2．释放(1)蒸馏水甲苯(2)涨破3．(1)①离心管离心(2)血红蛋白4．(1)透析袋三、1.(1)玻璃管(2)凹穴橡皮塞2．(2)溶胀(3)固定(4)装填(5)洗涤平衡3．(1)平齐(2)滴加(4)缓冲液面(5)洗脱四、1.洗涤次数不能过少；低速、短时离心2．沸水浴法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物和气泡3．装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流4．红色区带均匀一致地移动五、—聚丙烯酰胺凝胶电泳2.明显对点训练1．C[分子很大，完全不能进入凝胶内的任何孔隙的蛋白质洗脱出来的时间最短；分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小相应部分的蛋白质，洗脱出来的时间次之；分子很小，能进入分子筛全部孔隙内的蛋白质，洗脱出来的时间最长。]联想凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，相对分子质量很小，能进入分子筛的全部孔隙，运动速度最慢，路程最长；相对分子质量较大的，不能进入凝胶颗粒内，运动速度最快，路程最短。所以，蛋白质可以按不同顺序洗脱出来。规律链接凝胶色谱中分子彼此间较易分开的原因在凝胶色谱中会有三种情况：一是分子很小，能进入分子筛的全部内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。三类分子彼此间较易分开。2．C[若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的，分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶。]3．C[打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，在用同样的方法小心加入适量的20mmol/L的磷酸缓冲液，然后连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱。]规律链接血红蛋白提取与分离过程中的注意事项1．红细胞的洗涤(1)离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。(2)重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除血浆蛋白。2．血红蛋白的释放(1)蒸馏水的作用：使红细胞的细胞膜和核膜破裂。(2)甲苯的作用：溶解细胞膜。3．色谱柱填料的处理为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需1～2h。这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排出胶粒内的空气。4．凝胶色谱柱的装填在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。(1)在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。(2)在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。5．蛋白质的分离滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。4．D[洗涤红细胞的目的是去除血浆中除血红蛋白以外的杂蛋白；洗涤时离心速度过大，时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程选用%的生理盐水。]达标测试1．B[在一定pH作用下，生物大分子中有某些可解离的基团，这些基团会带上正电荷或负电荷，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。]2．B[分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液pH的影响，保持pH基本不变。]3．B[血红蛋白的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。其中样品处理又包括红细胞的洗涤、血红蛋白释放、分离血红蛋白溶液等步骤，其目的是获得血红蛋白溶液；粗分离即透析，其目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质，故B项描述错误。]4．A[凝胶的种类较多，但每种凝胶内部都有孔隙。相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质分子可以进入凝胶内部，通过的路程较长，洗脱时从凝胶柱中出来的较晚，相反相对分子质量较大的蛋白质分子则可以较早的洗脱出来，从而达到分离蛋白质的目的。]5．D[电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程，样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。]6．C[加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面齐平，关闭出口之后，用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端。]7．B[凝胶柱制作的一般流程是：选择玻璃管→选择合适的橡皮塞→打孔→挖凹穴→盖尼龙网→盖尼龙纱→将橡皮塞插到玻璃管→接尼龙管→装螺旋夹→柱顶插入安装玻璃管的橡皮塞。]8．C[洗脱过程中，如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。]9．(1)aa相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快(2)尼龙网和尼龙纱(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果(4)凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围凝胶得水值解析用凝胶色谱法分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。10．(1)样品处理粗分离纯化纯度鉴定(2)①防止血液凝固②红细胞的洗涤血红蛋白的释放(3)去除血浆蛋白(4)离心后的上清液没有黄色(5)低速500r/min；短时间如2min(6)离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度(7)①去除分子量较小的杂质②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内(8)通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去题组31．凝胶色谱法分离蛋白质的原理依据是()A．蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小B．蛋白质相对分子质量的大小C．蛋白质所带电荷的多少D．蛋白质溶解度的大小解析：凝胶色谱法所用的凝胶实际上是一些微小多孔的球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。答案：B2．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是()A．防止血红蛋白被氧气氧化B．血红蛋白是一种碱性物质，需磷酸中和C．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能解析：利用磷酸缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于分离观察和研究。答案：D3．洗涤红细胞时，离心所采用的方法是()A．低速长时间离心 B．低速短时间离心C．高速长时间离心 D．高速短时间离心解析：高速或长时间离心，会导致白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到纯净的红细胞，进而影响血红蛋白的提取纯度。答案：B4．右图表示对某蛋白质溶液进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(相似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述不正确的是()A．蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动B．蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少C．蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决于其相对分子质量的大小D．电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可能只有一种解析：蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷，故其移动速度与本身所带电荷无关，而由其分子大小决定。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链，故结果所示可能只有一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。答案：B5．血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据下面血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。(1)将实验流程补充完整。(2)凝胶色谱法的基本原理是根据________分离蛋白质。(3)洗涤红细胞的目的是去除________，洗涤干净的标志是____________________。(4)分离血红蛋白时，由上到下第_______________层是血红蛋白水溶液。(5)下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入示意图，正确的加样顺序是______。(6)如果红色区带____________，说明色谱柱制作成功。解析：(1)样品处理包括：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液和透析。凝胶色谱操作包括：凝胶色谱柱的制作、凝胶色谱柱的装填、样品的加入和洗脱。(2)凝胶色谱法的基本原理是根据相对分子质量的大小分离蛋白质。(3)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，洗涤干净的标志是上清液中没有黄色。(4)分离血红蛋白时，可明显看到试管中的溶液分为4层：第一层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层；第3层是红色透明液体，是血红蛋白的水溶液；第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。(5)加样顺序是：调整缓冲液面、滴加透析样品、样品渗入凝胶床、再调整缓冲液面。(6)如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。答案：(1)血红蛋白的释放凝胶色谱柱的装填(2)相对分子质量的大小(3)杂蛋白(或血浆蛋白)离心后的上清液中没有黄色(4)三(5)④①②③(6)均匀一致地移动题组41．用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质()A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快解析：凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。答案：D2．凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C．将酶或细胞固定在凝胶中D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度解析：凝胶的种类很多，但所有凝胶均是一些微小的多孔球体，小球内部有许多贯穿的通道，由于不同蛋白质相对分子质量不同，在凝胶中走过的路径不同，因而得以分离。答案：A3．相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的分离过程可表示为下图中哪一个()解析：根据分子筛效应可知，相对分子质量较大的蛋白质分子通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量小的分子后流出。答案：B4．血红蛋白的提取和分离一般分为四步，符合要求的是()A．粗分离→样品处理→纯化→纯度鉴定B．粗分离→纯化→样品处理→纯度鉴定C．样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定D．纯化→纯度鉴定→粗分离→样品处理解析：血红蛋白的提取和分离一般可分为四大步，包括样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。答案：C5．样品的加入和洗脱的操作不正确的是()A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面[B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶柱内C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D．用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面解析：加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐。答案：A6．使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于()A．电荷的多少 B．分子的大小C．肽链的多少 D．分子形状的差异解析：由于SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。答案：B7．(2011·广东高考)以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是()A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢解析：猪的成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少，是提纯血红蛋白的理想材料。提纯血红蛋白分四步：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析，其中洗涤红细胞时，要用生理盐水反复洗涤，既要将红细胞洗涤干净，又要不破坏红细胞，然后再用蒸馏水和甲苯使红细胞破裂，血红蛋白是根据相对分子质量的大小来分离的，相对分子质量大的蛋白质移动速度较快。血红蛋白的颜色可用于观察红色区带的移动情况，据此判断分离效果答案：D8．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，其分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是()A．将样品装入透析袋中透析12h，若分子乙保留在袋内，则分子丙也保留在袋内B．若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快C．若将样品以2000r/min的速度离心10min，分子戊存在于沉淀中，则分子甲也存在于沉淀中D．若用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最远解析：分子丙的相对分子质量大于分子乙，所以若分子乙保留在袋内，则丙也保留在袋内；甲相对分子质量最小，容易进入凝胶内部，则移动速度最慢；分子戊的相对分子质量大于甲，所以若分子戊存在于沉淀中，分子甲不一定存在于沉淀中；SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，蛋白质的迁移速度完全取决于分子的大小，因此，分子甲与丙形成的电泳带相距最远。答案：A9．(18分)蛋白质分子中，氨基酸的α－氨基和α－羧基虽然大部分都能结合形成肽键，但是蛋白质分子内仍含有各种酸性基团和碱性基团，如肽链末端的α－氨基和α－羧基、天冬氨酸和谷氨酸残基中的羧基、赖氨酸和组氨酸残基中的各种碱性基团，所以蛋白质是两性电解质。在酸性溶液中，碱性基团的解离程度增大，使蛋白质带正电荷；在碱性溶液中，酸性基团的解离程度加强，使蛋白质带负电荷。当溶液到达某一pH时，蛋白质可因内部酸性或碱性基团的解离程度相等而呈等电状态，这时溶液的pH叫做蛋白质的等电点。不处于等电点状态的蛋白质分子的正、负电荷量是不相同的。试回答下列问题。(1)多数蛋白质的等电点近于5，一般含碱性基团较多的蛋白质的等电点________(“偏高”还是“偏低”)(2)根据等电点的不同，可用________方法将不同种类的蛋白质分子分开。(3)简述根据等电点分离不同种类的蛋白质分子的原理。_________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)在血红蛋白提取和分离实验中，对分离得到的血红蛋白溶液要进行透析，除去相对分子质量较小的杂质蛋白质。请利用所给的实验材料对该透析实验进行验证。实验目的：验证透析的基本原理和操作。实验原理：①_______________________________________________________________________；②_____________________________________________________________________。实验材料：①透析管或透析袋②烧杯③玻璃棒④电磁搅拌器⑤试管及试管架实验试剂：①1mL血红蛋白溶液②300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为实验步骤：①________________________________________________________________________________________________________________________________________________；②_____________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：含碱性基团较多的蛋白质溶液，在pH近于5时解离程度较大，蛋白质带正电荷。要使蛋白质内部酸性和碱性基团解离程度相等，呈等电状态，必须提高溶液的pH，使酸性基团解离程度增大，故蛋白质的等电点提高。根据等电点不同，可以利用电泳法将特定的蛋白质分离出来。透析是应用半透膜的选择性，去除分子质量相对较小的杂质，从而达到对血红蛋白的粗分离。答案：(1)偏高(2)电泳(3)调节电泳槽中缓冲液的pH，使某种蛋白质处于等电点状态，而其他蛋白质带有电荷，在电场作用下，带有正、负电荷的蛋白质分别移向两极，而不带电荷的蛋白质留在原处。(4)实验原理：①蛋白质是大分子物质，不能透过透析袋，而小分子物质可以自由透过②在分离提纯蛋白质的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开实验步骤：①取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液的烧杯中②不断更换烧杯中的缓冲液，并用电磁搅拌器不断搅动缓冲液，以加速透析过程，透析12h题组51．利用凝胶色谱法先洗脱出来的蛋白质是()。A．相对分子质量大的 B．溶解度高的C．相对分子质量小的 D．所带电荷多的解析相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。答案A2．将经处理破裂后的红细胞混合液以2000r/min的速度离心10min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是()。A．血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层B．甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层C．脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层D．甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层解析混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层；第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第4层为暗红色沉淀物，主要是红细胞破碎物沉淀。答案D3．下列关于电泳的说法不正确的是()。A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少D．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小解析蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。答案C4．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如下图所示。下列叙述正确的是()。A．将样品装入透析袋中透析12h，若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内B．若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快C．将样品以2000r/min的速度离心10min，若分子戊存在于沉淀中，则分子丙也存在于沉淀中D．若五种物质为蛋白质，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最近解析透析的原理是相对分子质量小的物质能透过半透膜，相对分子质量大的物质不能透过，乙保留在袋内，甲则不一定保留在袋内；凝胶色谱柱分离时，相对分子质量小的物质路程长、移动慢；离心时相对分子质量大的物质先沉淀，戊沉淀，则乙、丁、丙均已沉淀；用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时，电泳迁移率主要取决于分子大小。答案C5．下面说法不正确的是()。A．在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸、碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成C．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程D．透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内解析透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质。答案D6．(10分)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。(1)将实验流程补充完整：A为________，B为________。凝胶色谱法是根据______________________而达到蛋白质分离的有效方法。(2)洗涤红细胞的目的是去除________，洗涤次数过少，无法除去________；离心速度过高和时间过长会使________一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是__________。释放血红蛋白的过程中起作用的是__________。(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为的目的是__________________。如果红色区带__________，说明色谱柱制作成功。解析凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，在蛋白质分离与提取过程中包括样品的处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四步，每一步均应用了不同的操作技术，需要注意。答案(1)血红蛋白的释放样品的加入和洗脱相对分子质量的大小(2)杂蛋白(血浆蛋白)血浆蛋白白细胞和淋巴细胞离心后的上清液中没有黄色蒸馏水和甲苯(3)准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致均匀一致地移动7．(8分)蛋白质分子中，氨基酸的α­氨基和α­羧基虽然大部分结合成为肽键，但是蛋白质分子内仍含有各种酸性基团和碱性基团，如肽链末端的α­氨基和α­羧基、天冬氨酸和谷氨酸残基中的羟基、赖氨酸和组氨酸残基中的各种碱性基团，所以蛋白质是两性电解质。在酸性溶液中，碱性基团的解离增大，使蛋白质带正电荷；在碱性溶液中，酸性基团的解离加强，使蛋白质带负电荷。当溶液到达某一pH时，蛋白质可因内部酸性和碱性基团的解离相等而呈等电状态，这时的溶液pH叫做蛋白质的等电点。不处于等电点状态的蛋白质分子的正、负电荷量是不相同的。试回答下列问题。(1)多数蛋白质的等电点近于5，一般含碱性基团较多的蛋白质的等电点________(填“偏高”或“偏低”)。(2)根据等电点的不同，你能用________方法将不同种类的蛋白质分子分开。(3)简述根据等电点分离不同种类的蛋白质分子的原理。解析本题深入到蛋白质内部，从蛋白质分子带电性质及数量的角度，引导学生理解电泳法分离蛋白质的原理。含碱性基团较多的蛋白质溶液，在pH近于5时解离程度较大，蛋白质带正电荷。要使蛋白质内部酸性和碱性基团解离相等呈等电状态，必须提高溶液的pH，使酸性基团解离增加，故蛋白质的等电点提高。根据等电点不同，可以利用电泳法将特定的蛋白质分离出来。答案(1)偏高(2)电泳(3)调节电泳槽中缓冲液的pH，使某种蛋白质处于等电点状态，而其他蛋白质带有电荷，在电场作用下，带有正、负电荷的蛋白质分别移向两极，而不带电荷的蛋白质留在原处。8．(12分)凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答下面的问题。(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是______，原因是________________________。(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由________替代。(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是________________________。(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体______(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是________。解析用凝胶色谱法分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以减少凝胶颗粒之间的空隙。在装填凝胶色谱柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。答案(1)aa的相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快(2)尼龙网和尼龙纱(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果(4)相同保持稳定题组61．使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为下图中()解析：凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。答案：B2．使用SDS—聚丙烯酰胺电泳的过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于()A．电荷的多少B．分子的大小C．肽链的多少D．分子形状的差异解析：SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带的负电荷量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。答案：B3．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是()A．防止血红蛋白被氧气氧化B．血红蛋白是一种碱性物质，需磷酸中和C．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和性质解析：磷酸缓冲液的作用是稳定pH，从而维持血红蛋白的结构和性质。答案：D4．电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快？()A．纤维状、大分子B．纤维状、小分子C．球状、大分子D．球状、小分子答案：D5．用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是()A．相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B．相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C．相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D．二者根本无法比较答案：A6．蛋白质提取和分离分为哪几步()A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定解析：蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。答案：C7．电泳技术可分离和分析氨基酸和核苷酸等有机物，下图是把含有21个氨基酸的多肽进行水解，将氨基酸混合物进行电泳的结果。据图分析该多肽由多少种氨基酸组成？()A．6B．4C．5D．3解析：电泳分离方法主要就是根据大分子的相对分子质量及电性差异将大分子在电场中彼此分离开来。由于组成多肽的氨基酸的相对分子质量、所带电荷不同，会形成不同的电泳带，而题图显示形成四条电泳带，所以该多肽由四种不同氨基酸组成。答案：B8．在血红蛋白的提取和分离实验中，下列操作正确的是()A．分离红细胞时需去除上层透明的黄色血浆B．红细胞释放出血红蛋白时只需加入蒸馏水C．分离血红蛋白溶液是低速短时间离心D．洗脱时，待红色蛋白质下移即开始收集流出液解析：分离红细胞时要及时除去血浆蛋白。释放红细胞时需要加入蒸馏水和甲苯。分离血细胞时，要短时低速离心，即一般为500r/min，离心2min，否则白细胞会一同沉淀，达不到分离效果。分离血红蛋白时要高速长时间离心，以2000r/min的速度离心10min。洗脱时待红色的蛋白质接近色谱柱底端用试管收集流出液。答案：A9．以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是()A．洗涤血红细胞时，使用生理盐水可以防止红细胞破裂B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢解析：在凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的分子无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。所以血红蛋白分子比相对分子质量较小的杂分子移动速度要快。答案：D10．分离血红蛋白时，将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的溶液分为4层。下列描述中，正确的是()A．第1层为无色透明的甲苯层B．第2层为红色透明层，含血红蛋白C．第4层为白色薄层固体，是脂溶性沉淀物D．第3层为暗红色沉淀物，含未破裂的细胞解析：采集的血样先经处理分离出红细胞，然后在蒸馏水和甲苯的作用下，使红细胞破裂释放出血红蛋白。分离血红蛋白时，将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的溶液分为4层：第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层；第3层是红色透明液体，是血红蛋白的水溶液；第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性杂质沉淀层，于分液漏斗静置片刻后，分出下层的红色透明液体即血红蛋白溶液。答案：A11．下列试剂可用于血红蛋白释放的是()A．生理盐水B．甲苯C．磷酸缓冲液D．蒸馏水解析：在蒸馏水中红细胞吸水胀破，甲苯作为有机溶剂能够溶解细胞膜，加速细胞的破裂。答案：BD12．用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质()A．路程较长B．路程较短C．移动速度较慢D．移动速度较快解析：在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。答案：BD13．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的。我们可以选用猪、牛、羊等动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：(1)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。①其中加入柠檬酸钠的目的是__________________________________________________________。②此过程即是样品处理，它应包括红细胞洗涤、________________、分离血红蛋白溶液。③洗涤红细胞的目的是__________________________________________________________。解析：柠檬酸钠是一种抗凝剂，加入柠檬酸钠可以防止血液凝固；样品处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液；洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。答案：①防止血液凝固②血红蛋白的释放③去除杂蛋白(2)收集的血红蛋白溶液在透析袋中透析，这就是样品的粗分离。①透析的目的是__________________________________________________________。②透析的原理是________________________________________________________________________________________________________________。解析：透析袋一般是用硝酸纤维素制成的，透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内，透析可以去除样品中分子量较小的杂质或用于更换样品的缓冲液。答案：①去除相对分子质量较小的杂质②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内(3)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。其中通过凝胶色谱法将样品纯化的目的是__________________________________________________________________________________________________________________________________________解析：凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法，因此，通过用凝胶色谱法去除相对分子质量较大的杂质。答案：通过凝胶色谱法去除相对分子质量较大的杂质14．血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。(1)将实验流程补充完整。(2)凝胶色谱法的基本原理是根据__________________分离蛋白质。(3)洗涤红细胞的目的是去除________，洗涤干净的标志是_____________________________________________________________________(4)分离血红蛋白时，由上到下第________层是血红蛋白水溶液。(5)下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入示意图，正确的加样顺序是________。(6)如果红色区带________________，说明色谱柱制作成功。解析：(1)样品处理包括：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液。凝胶色谱操作包括：凝胶色谱柱的制作、凝胶色谱柱的装填、样品的加入和洗脱。(2)凝胶色谱法的基本原理是根据相对分子质量的大小分离蛋白质。(3)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，洗涤干净的标志是上清液中没有黄色。(4)分离血红蛋白时，可明显看到试管中的溶液分为4层：第一层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层；第3层是红色透明液体，是血红蛋白的水溶液；第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。(5)加样顺序是：调整缓冲液面、滴加透析样品、样品渗入凝胶床、再调整缓冲液面。(6)如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。答案：(1)血红蛋白的释放凝胶色谱柱的装填(2)相对分子质量的大小(3)杂蛋白(或血浆蛋白)离心后的上清液中没有黄色(4)三(5)④①②③(6)均匀一致地移动题组71．凝胶色谱法是根据以下哪项分离蛋白质的()A．对凝胶的吸附性 B．相对分子质量的大小C．带电荷的多少 D．溶解度解析：凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。答案：B2．(2011·广东高考)以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是()A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少[C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢解析：相对分子质量越大的通过凝胶色谱柱的速度越快。答案：D3．下列关于蛋白质的提取与分离的叙述正确的是()A．在凝胶色谱柱内，分子质量较大的蛋白质路程较长，但移动速度较快B．从凝胶色谱柱中最后分离出来的是分子质量较小的蛋白质C．蛋白质的分离使用最多的方法是SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳法D．分离血红蛋白溶液时，离心管的第三层是脂类物质解析：在凝胶色谱柱内，分子质量大的蛋白质不能进入凝胶内，路程短，移动速度快，而分子质量小的蛋白质会进入凝胶内，路程长，移动速度慢，最后洗脱出来的是分子质量较小的蛋白质；SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳法是蛋白质纯度鉴定使用最多的方法；分离血红蛋白溶液时，离心管中将出现四层，其中第三层就是血红蛋白溶液，而不是脂类物质。答案：B4．SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是()A．蛋白质分子所带的电荷B．蛋白质分子的形状C．蛋白质分子的相对分子质量D．缓冲溶液的pH解析：在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成单条肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白质­SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，从而达到仅根据蛋白质相对分子质量的不同来分离蛋白质的目的。答案：C5．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2。我们可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：(1)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：________、________、________和________。(2)实验前取新鲜的血液，切记要在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，立即进行离心，收集血红蛋白溶液。以上所述的过程即是样品处理，它包括红细胞的洗涤、________、收集血红蛋白溶液。答案：(1)样品处理粗分离纯化纯度鉴定(2)血红蛋白的释放1．下列有关“血红蛋白的提取和分离”的相关叙述中，正确的是()A．用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去除细胞表面的杂蛋白B．将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较大的杂质C．血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂D．血红蛋白的提取和分离一般分为样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定解析：A项是用生理盐水洗涤；B项中的血红蛋白质为大分