发酵过程的实验室研究中试和放大

发酵过程的实验室研究、

中试和放大常规放大进程第一节小试（实验室研究）一、小试设备：

生化培养箱、摇床/摇瓶柜、小型发酵罐。

(一)、摇瓶机：往复式：80-120rpm，冲程80-120mm；用于培养细菌、酵母等单细胞菌体；旋转式：60-300rpm，偏心距30-60mm。传氧速率好、培养液不会溅瓶口。（普遍采用）摇瓶实验影响微生物生长的物理因素：1.瓶塞是氧传递的限制因素2.水蒸发的影响影响培养液的体积，改变氧传递效率，改变菌体产物浓度3.比表面积的影响(二）、小发酵罐10L以下罐：玻璃罐较多，大多2级搅拌，六平叶，一般最大600rpm，环形空气分布管。30-150L罐：不锈钢罐，3级搅拌，六平叶/弯叶，一般最大500-550rpm，空气分布器：直管。都配有DO、pH、T、泡沫等传感器。（可直接检测控制温度、搅拌转速、通气流量、罐压、消泡、pH、DO、发酵液体积、补料量、排气CO2

和O2

等十多个在线参数）发酵罐（液体发酵）的种类：密闭厌氧发酵罐通气搅拌发酵罐机械搅拌通风发酵罐

自吸式发酵罐气升式发酵罐

密闭厌氧发酵罐2.1机械搅拌通风发酵罐图6-1小型发酵罐结构图1.三角皮带转轴；2.轴承支柱；3.联轴节；4.轴封；5.窥镜；6.取样口；7.冷却水出口；8.夹套；9.罐壁；10.温度计；11.轴；12.搅拌器；13.底轴承支架；14.放料口；15.冷水进口；16.通风管；17.热电偶接口；18.挡板；19.接压力表；20.手孔；21.电动机；22.排气孔；23.取样口；24.进料口；25.压力表接口；26.窥镜；27.手孔；28.补料口图6-2；大型发酵罐结构图1.轴封；2.人孔；3.梯子；4.联轴节；5.中间轴承；6.热电偶接口；7.搅拌器；8.通风管；9.放料口；10.底轴承；11.温度计；12.冷却管；13.轴；14.取样；15.轴承柱；16.三角皮带传动；17.电动机；18.压力表；19.取样口；20.人孔；21.进料口；22.补料口；23.排气口；24.回流口；25.窥镜搅拌器和挡板

1搅拌器的作用，型式及特点

搅拌器的作用

打碎气泡，产生漩涡，提高氧的利用率促进传质和传热液体流型：径向流、轴向流、切向流

流型径向流（叶片对液体施以径向离心力，流体流动的方向垂直于搅拌轴，沿径向流动，碰到容器壁面分成两股流体分别向上、向下流动，再回到叶端，不穿过叶片，形成上、下两个循环流动。）特点：剪切作用较强，混合效果较差流型轴向流（流体流动方向平行于搅拌轴，流体由桨叶推动，使流体向下流动，遇到容器底面再翻上，形成上下循环流）特点：剪切作用较弱，混合效果较好流型切向流（无挡板的容器内，流体绕轴作旋转运动，流速高时液体表面会形成旋涡，此时流体从桨叶周围周向卷吸至桨叶区的流量很小，混合效果很差。）特点：剪切作用和混合效果很差螺旋桨搅拌器轴向流的代表优点：混合效果好缺点：剪切作用差，不能阻止气流沿搅拌轴上升，不能打碎气泡，不利于溶氧，只用于培养基的配制，料液的混合。轴向流搅拌器的型式和特点径向流搅拌器的型式与特点圆盘平直叶涡轮搅拌器：是径向流的代表，在圆盘上焊有六片平直叶，圆盘可阻止气体沿搅拌轴上升，轴向流差，不利于混合，剪切作用强，有利于打碎气泡，溶氧效果好，功率消耗大。圆盘弯叶涡轮搅拌器：径向流较差，轴向流较强，混合效果较好，剪切作用不如平直叶，溶氧效果不如平直叶，功率消耗小。圆盘箭叶涡轮搅拌器：轴向流强，径向流差，剪切作用小，混合效果最好，溶氧效果差，功率消耗最小。++++++++++箭叶++++++++++++弯叶++++++++++++++平直叶输出溶氧混合剪切径向流轴向流型式菌丝体发酵单细胞发酵应用几种涡轮搅拌器作用比较2挡板

（a）（b）（c）（a）周边无档板；（b）螺旋桨搅拌器周边有垂直档板；（c）涡轮搅拌器周边有垂直档板43挡板的作用：改变液流的方向，将切向流改为轴向流,防止产生漩涡。提高搅拌混合效果，提高湍流强度.数目通常为4～6块，其宽度为0.1～0.12D。全挡板条件：是指在搅拌罐中再增加挡板或其它附件时，搅拌功率不再增加。（消除液面漩涡的最低条件）。式中：D—罐的直径（mm）Z—挡板数W—挡板宽度（mm）用来校验档板数是否够3消泡器作用：打碎泡沫，防止逃逸型式：锯齿状，梳状，孔板状，一般安装在搅拌轴上高出液面的部位，随搅拌轴转动而转动，将泡沫打碎。长度：

L=0.65D4空气分布管作用：使通入的空气均匀分布型式：单管式正对罐底，距罐底40mm，罐底衬不锈钢圆板，防空气冲击

环式易堵。需要变速的原因：电机的转速大于搅拌器所需转速。电机分四级，转速分别约为：

800、1000、1400、1600rpm；而搅拌转速则一般为90-110rpm。发酵罐常用的变速装置有三角皮带传动。5传动装置（1）变速装置（2）搅拌轴：有上悬式和下伸式两种作用：对轴固定，防止摆动，同时又不影响转动轴承结构6.轴封

轴封的作用：使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止泄露和污染杂菌。形式：填料函轴封、机械轴封两种。

1-轴2-填料压盖3-压紧螺栓

4-填料箱体

5-铜环6-填料填料函轴封机械轴封又称端面轴封，由弹性元件、动环和静环组成。动环固定在轴上，随轴一起转动。静环装在壳体上。动环依靠弹簧的压力与静环紧密接触，阻止流体泄漏。由两个环的端面互相密切贴合而达密封目的。

依靠三个密封点达到完全密封：1

动环与静环之间的密封2

静环与压盖之间的密封3

动环与轴之间的密封1-弹簧2-动环3-硬质合金4-静环5-O形密封圈

搅拌器轴功率的计算全档板条件下，对于牛顿型流体通过因次分析，得：式中P0：不通气时搅拌器输入液体的功率（瓦）

ρ：液体的密度（公斤/米3）

μ：液体的粘度（牛.秒/米2）

D：涡轮直径（米）

N：涡轮转数（转/秒）

K，m：决定于搅拌器的型式，挡板的尺寸及流体的流态1.单只涡轮在不通气条件下输入搅拌液体的功率的计算是一个无因次数，可定义为功率准数NP。该准数表征着机械搅拌所施与单位体积被搅拌液体的外力与单位体积被搅拌液体的惯性之比。式中ω：涡轮线速度

a：加速度

V：液体体积

m：液体质量

是一个无因次数，称为功率准数NP

。是一个无因次数，称为搅拌雷诺数ReMNP~ReM

的关系：实测找出规律，即经验系数K，m当ReM＜10时，液体为层流状态，m=-1；当ReM＞104时，液体为湍流状态，m=0；多数发酵罐搅拌器在此范围，故Np=常数＝K，查图得Np

。ReM＞104，达到充分湍流之后

P0=NPD5N3ρ2，多只涡轮在不通气条件下输入搅拌液体的功率计算使用多个涡轮时，两者间的距离S，对非牛顿型流体可取为2D，对牛顿型流体可取2.5~3.0D；静液面至上涡轮的距离可取0.5~2D，下涡轮至罐底的距离C可取0.5~1.0D。符合上述条件的发酵罐，用经验公式计算或实测结果都表明，多个涡轮输出的功率近似等于单个涡轮的功率乘以涡轮的个数。迈凯尔的修正关系式3，通气液体机械搅拌功率的计算计算举例某细菌醪发酵罐罐直径T＝1.8(米)圆盘六弯叶涡轮直径D＝0.60米，一只涡轮罐内装四块标准挡板搅拌器转速N＝168转／分通气量Q＝1.42米3／分(已换算为罐内状态的流量)罐压P＝1.5绝对大气压醪液粘度μ＝1.96×10-3牛·秒／米2醪液密度ρ＝1020公斤／米3要求计算Pg(1)计算ReMReM=5.25×104(2)由NP~ReM查NP

，NP=4.7(3)计算P0P0=NPD5N3ρ=8.07（千瓦）(4)计算Pg7换热装置（1）作用：实消时预热和冷却，发酵过程中的冷却和加热。（2）型式：夹套、竖式蛇管、列管夹套：5m3以下的罐子采用，冷却水流速低，传热系数小，换热效果差。但能减少罐内附件，减少死角。冷却蛇管：罐内装4-6组，水流速度快，但管径小，流量小，适用于冷却水温度低的地区。冷却列管：罐内装4-6组，管径大，耗水量大，降温快，适用于冷却水温度高的地区。冷却面积的计算

传热系数的经验值或计算

夹套K为4.187*（150-250）kJ/m2hK

蛇管K为4.187*（300-450）kJ/m2hKT、t1、t2

分别为醪温、冷却水进出口温度Q总——每1m3醪液在发酵最旺盛时，1h的发热量与醪液总体积的乘积cp——冷却水的比热容t2——冷却水终温，t2=27℃t1——冷却水初温，t1=20℃W——冷却水体积流量V——冷却水流速25罐体的尺寸比例（重点）通用发酵罐通常取值系数范围搅拌器直径d=1/3D1/2－1/3罐筒身高

H0=2D1.7－3挡板宽度B=0.1D1/8－1/12

搅拌器间距S=2d1.5－2.5

下搅拌器距底间距C=d0.8－1.0挡板与罐壁的距离（1/5-1/8）BHL：装料的液面高度。ha：封头凸出部分的高度，标准椭圆封头有ha＝0.25D。Hb：封头直边高度，据壁厚一般取25、40、50mm。

机械搅拌通风发酵罐的优缺点优点:操作弹性大，pH值和温度易于控制；有较规范的工业放大方法；适合连续培养。缺点:驱动功率大；内部结构复杂，难于彻底洗净,易造成污染；在丝状菌的培养中由于搅拌器的剪切作用，细胞易损伤2.2自吸式发酵罐定子的作用：将气体与液体混匀，甩出，将大气泡打碎，促进溶氧。转子的作用：将转子内的液体甩出，形成内部真空，将气体吸入。

优点:利用机械搅拌的抽吸作用将空气自吸入反应器内,达到既通风有搅拌的目的，从而省去了压缩机。缺点:进罐空气处于负压，因而增加了染菌机会，且搅拌转速甚高，有可能使菌丝被切断，使正常的生长受到影响。2.3气升式发酵罐优点：能耗低，液体中的剪切作用小，结构简单，且由于省去了机械搅拌而不需机械密封，避免了因机械密封不良造成的杂菌污染。缺点：它不适用于高粘度或含大量固体的培养液。1、实验室研究的目的：菌种保藏菌种在固体培养基上培养和繁殖的条件研究培养基最适组分实验室规模的培养技术（三）实验室研究和统计学方法2、研究的步骤先确定培养基组分通气强度影响代谢产物产量的关键因素摇瓶实验：提供基本信息和初步发酵工艺数据三.实验室研究和统计学方法3、统计学方法

一般实验正交试验均匀实验响应面实验10.2摇瓶培养与罐培养的差异和发酵规模改变的影响一、摇瓶和罐培养的差异1.体积氧传递系数（KLa）和溶解氧的差异2.CO2浓度的差异3.菌丝受机械损伤的差异除此之外，还有哪些差异?消毒方式、接种方式、通气方式、蒸发量、搅拌方式、pH控制、温度控制、检测手段1增加摇瓶机的转速2减少培养基的装量3直接向摇瓶中通入无菌空气或氧气等措施4可在摇瓶中加入玻璃珠来模拟发酵罐的机械搅拌来研究因搅拌引起的差异从下面四个方面模拟罐上发酵的条件二、

发酵罐规模改变的影响几何相似、不同规模的发酵罐对比，改变的主要因素有：

菌体繁殖代数种子的形成培养基的灭菌通气和搅拌热传递菌体繁殖代数的差异Ng=1.44(lnV+lnx-lnX0)Ng：菌体繁殖代数V：发酵罐体积m3x：菌体浓度kg/m3X0：总菌体量kg2.培养基灭菌的差异分批灭菌：预热期、维持期、冷却期培养基体积越大，预热期和冷却期越长对培养基破坏越严重3.通气与搅拌的差异4.热传递的差异5.种子形成的差异发酵放大过程中，菌种质量和其它发酵工艺也会改变10.3发酵规模的缩小和放大一、概述缩小（scaledown）：大规模发酵生产条件作为中小型实验条件放大（scaleup）：实验室和中试车间结果应用到大规模发酵工业中二.放大或缩小的关键因素小设备、大设备的环境条件分析（尽量一致）：化学因素：基质、前体浓度等，人为控制可保持恒定；物理因素：温度、菌浓、粘度、压力、功率消耗、剪切力等。有差异第一阶段实验室规模，进行菌种的筛选和培养基的研究三.放大的过程第二阶段中试工厂规模，确定菌种培养的最佳操作条件第三阶段工厂大规模生产四、生物反应器的放大的原理与准则生物反应器的放大的原理

——相似原理

即实验反应系统和放大反应系统的生物化学反应过程、流体流动与动量传递、热量和质量传递过程，能用相同的微分方程来描述，并具有相同的特征，则两个系统具有相同的行为方式。理想反应器放大应达到的相似条件：1、几何相似性2、流体力学相似性3、热力学相似性4、质量（浓度）相似性5、生物化学相似性

经验放大法

缩小-放大法因次分析法数学模型法

五、生物反应器的放大方法数学模拟放大法进行发酵罐的放大基础实验测定值过程模拟用计算机作方案研究实验参数范围的制定小试中试基础模型的修正模型放大实验用计算机作设计计算过程的基本设计计算结果与实验结果的比较六、通气发酵罐的设计------经验放大法一、几何相似放大按反应器的各个部件的几何尺寸比例进行放大。放大倍数实际上就是反应器的增加倍数。二、恒定等体积搅拌功率放大

这种方法适用对于以溶氧速率控制发酵反应的生物发酵，粘度较高的非牛顿型流体或高细胞密度的培养。对于不通气时的机械搅拌生物反应器，轴功率计算

对于通气式机械搅拌生物反应器，可取单位体积液体分配的通气搅拌功率相同的准则进行放大

0.01143三、恒定体积溶氧系数放大这种方法适用于牛顿性流体、高耗氧发酵（细菌发酵、酵母发酵）发酵过程的反应器的放大。(1)以福田秀雄的关联式为放大基准

Kd=(2.36+3.30m)·(Pg/V)0.56·Vs0.7·N0.7·10-9m---搅拌涡轮的个数

KLa∝(Pg/V)0.

56Vs0.7N0.7P0=NpN3D5V=π/4·D2H

Qg=π/4·D2Vs

所以Pg/V∝{(N3D5)2ND3/(D2Vs)0.08}0.39/(D2H)

得Pg/V∝N2.73D2.01/Vs0.03KLa∝N2.23Vs0.68D1.13按(KLa)2=(KLa)1原则N2=N1[Vs]1/(Vs)2]0.30(D1/D2)0.51(pg)2=(pg)1[Vs]1/(Vs)2]0.849(D1/D2)0.99(2)以另一文献报导关联式为放大基准Qg--操作状态下的通气流量VL--发酵液体积HL--液柱高度∵

∴

又∵∴

P为操作状态下通入的空气的压力四、恒定搅拌叶尖线端速度放大适用于生物细胞受搅拌剪切影响较明显的发酵过程的放大，例如丝状菌的发酵。搅拌叶尖线端速度（πDn）是决定搅拌剪切强度的关键。桨叶尖端线速度：五、恒定混合时间放大混合时间是指在反应器中加入物料，到它们被混合均匀时所需的时间。在小反应器中，比较容易混合均匀，而在大反应器中，则较为困难。

ft——混合时间函数；

tM——混合时间，s；

n——搅拌转速，r/s；

Di——搅拌叶轮直径，m；

D——发酵反应器直径，m；

HL——罐内液体深度，m；

g——重力加速度常数，9.81m/s2。FOX用因次分析法，当Re＞105，得出以下关系式混合时间函数ft与Re关系

以混合时间相等的准则进行放大对几何相似的发酵罐，当Re＞105时：当应用（P0/VL）1=（P0／VL）2原则放大时，n2／n1＝（Di1／Di2）2/3：

六、空气流量放大∵∴∵∴∵

∴

又∵∴

欧洲发酵工业中的放大准则工业应用的比例（%）所采用的经验放大基准30单位培养液体积消耗功率相等30kLa恒定20搅拌桨叶端速度恒定若V2/V1=125，D2=5D1，P2=1.5P1，则用上述三种不同方法计算放大后的通气量结果如下表。放大方法VVM值

Vs值放大前放大后放大前放大后VVM相同1113.33

Vs相同10.311

kLa相同10.51311.71机械搅拌罐放大过程测定试验罐的Qg、n、发酵速率及几何尺寸测定发酵液的特性：r、m计算试验罐的vvm、Qg/(nd3)、pnd及Re等预算NP、P、Pg和kLa等根据生产量和产率选择发酵罐的体积和个数按几何相似原则计算放大罐的尺寸确定放大准则，通常对高耗氧生物反应用kLa相等原则计算Q和N根据vvm相等原则、Q/(nd3)相等原则、us相等原则确定Q根据Pg与kLa关系计算n估算搅拌功率例：机械搅拌罐经验放大法某厂在100L机械搅拌罐中进行淀粉酶生产试验，所用的菌种为枯草杆菌，获得良好的发酵效果，拟放大至20m3生产罐，粘度μ=2.25×10-3Pa·S，密度ρL=1020

kg/m3。试验罐的尺寸为:直径D=375mm，搅拌叶轮d=125mm(D/d=3.0)，高径比H/D＝2.4，液深HL=1.5D，4块档板的W/D=0.1，装液量为60L，通气速率1.0vvm，使用2档圆盘六直角叶涡轮搅拌器，转速n=350r/min。通过实验，证明此发酵为高耗氧的生物反应，故可按体积溶氧系数相等之原则进行放大。筒身高度H罐径D档板宽度W液位高度HL搅拌器直径d两搅拌器间距s下搅拌器距底部的间距B(1)依据几何相似的原则计算发酵罐尺寸试验罐D=375mm，d=125mm(2)按几何相似原则确定20m3生产罐的尺寸：据题设几何尺寸比例，放大罐与小罐相同，则有H/D＝2.4,D/d=3.0,HL/D=1.5,而有效装料体积仍取60%，由此可得：可得D=2.17m,H=2.4D=5.20m,d=D/3=0.72m,HL=1.5D=3.26m这是按几何相似原则计算求得的20m3生产罐的尺寸。仍采用两组圆盘六直叶涡轮搅拌器。以体积溶氧系数相等为基准以福田秀雄的关联式为放大基准

Kd=(2.36+3.30m)·(Pg/V)0.56·Vs0.7·N0.7·10-9以以下关联式为放大基准以体积溶氧系数相等为基准(3)计算试验罐的kLa先求搅拌雷诺准数ReM由功率准数NP视搅拌强度及叶轮形式而定.当发酵系统充分湍流时,即ReM>=104时,对圆盘六直叶涡轮,NP=6.0;对圆盘六弯叶涡轮,NP=4.7;而对圆盘六箭叶涡轮,NP=3.7，由于此处ReM>104,为圆盘六直叶涡轮，因此NP取为6.0以体积溶氧系数相等为基准所以2档叶轮的不通气时的搅拌功率为

：相应地，通气搅拌功率为

：(下式中Qg的单位是ml/min)从而可以算出体积溶氧系数

：其中空截面气速为

：(3)决定大罐的通气流率Qg:按几何相似原则放大设备，放大倍数越高，其单位体积液体占有的发酵罐横截面越小，若维持通气强度vvm不变，则放大后空截面气速则随罐容增大而迅速提高。因：通气量Qg在维持通气强度vvm不变时，就有Qg∝VL∝D3而空截面气速为：若按通气强度不变，即取大罐的通气速率为1.0vvm，可算出通气量及相应的空截面气速为：对比小罐的空截面气速(us=54.3cm/min),可见，若按通气强度不变，则大罐的通气截面气速约相当于小罐的6倍。经验表明，这种气速太高。故可折中取大罐的us=150cm/min,由此可计算出大罐的通气速率为：通气强度为：5.55/12=0.462vvm(4)按kLa相等原则计算放大罐的搅拌转速和搅拌功率7.01x10-6=7.434x10-8Pg0.56n0.7即：Pg=3356n-1.25又根据Pg的又一表达式：即：比较两个不同的Pg表达式可得：由搅拌轴功率公式可计算得到：联立上面二式可计算得到：n=123r/minP=10.2kWPg=8.19kWPg=3356n-1.25试验罐与放大计算结果比