陈娜娜 开题报告

浙江大学·动物科学学院蛋氨酸锌络（螯）合物在产蛋鸡上的耐受性研究ResearchoftheEnduranceofZinc-MethioneininLayingHens陈娜娜214170712015-4-28主要内容

研究内容2试验方案3

立题依据1试验创新4进度安排5立题依据1蛋氨酸锌概念及营养学特性2蛋氨酸锌在蛋鸡生产中的应用2蛋氨酸锌应用中存在的问题立题依据蛋氨酸锌由蛋氨酸与无机锌以1：1或2：1的摩尔比例在特定条件下生成的具有独特环状结构的金属络（螯）合物，是一种类似动物体内吸收和发挥生物功能形式的有机微量元素添加剂。蛋氨酸锌是农业部“1224号公告”中允许使用的有机微量元素添加剂，在畜禽生产上使用广泛。Zn(C5H10NO2S)2（C5H10NO2SZn）HSO4立题依据1、蛋氨酸锌络（螯）合物的营养学特性与无机锌相比，蛋氨酸锌具有生物学效价高、双重营养功能、毒副作用小等营养特点。（1）生化性质稳定，对饲粮成分破坏小在蛋氨酸锌中，锌离子以共价键和离子键两种键合形式与蛋氨酸配位体结合形成特殊的环状结构。——这种特殊的环状结构可以抵抗或缓解锌与其它矿物质元素（例如钙、铜、锰）的拮抗作用；——同时避免或减少植酸、纤维与锌离子在肠道内螯合，从而可以提高锌的吸收率；——同时还能减轻金属离子氧化还原反应对饲粮维生素的破坏，从而减少营养物质的损失。一、项目任务来由（背景）（2）蛋氨酸锌的生化特性接近锌在动物体内的吸收利用方式，生物学效价高蛋氨酸锌的生化特性接近锌在动物体内的吸收利用方式，能有效促进锌离子运输到特定靶组织和酶系统并发挥相应生物学功能，具有良好的组织定向，减少许多生化过程，节约体能消耗，生物学效价高，能满足禽类在生长发育、繁殖、应激等特殊时期的需求，并减少锌的排放。（3）蛋氨酸锌的双重营养功能此外，蛋氨酸锌既可以满足机体所需微量元素——锌，又可以补充禽类玉米豆粕型饲粮中第一限制性氨基酸——蛋氨酸，具有双重营养功能，其作用效果优于无机锌。立题依据（4）蛋氨酸锌作为“独立单元”发挥特殊的营养功能蛋氨酸不仅能够提高锌的生物学利用率，还能作为“独立单元”发挥特殊的营养功能，如增强抗菌能力、抗应激、改善畜禽繁殖性能等，从而最大程度提高动物生产性能，可起到部分代替抗生素的作用。立题依据2蛋氨酸锌在蛋鸡生产中的研究进展（1）国外关于蛋氨酸锌在蛋鸡生产中的研究进展Jackson等对63~88周龄的商品蛋鸡进行试验，发现饲粮中添加蛋氨酸锌可显著降低蛋鸡的死亡率（8.9%）,并且产蛋率提高8.57%%，其产蛋性能明显提高。Kienholz等报道，蛋氨酸锌能缓解产蛋鸡的应激，增强其对室内高温、低钙日粮的适应能力。还有研究表明，蛋氨酸锌能显著提高7周龄T淋巴细胞转化指数（18.06%)、抗体IgG含量（12.02%),降低死亡率（7.65%）及球虫病发病率（1.66%）。立题依据2蛋氨酸锌在蛋鸡生产中的研究进展（2）国内关于蛋氨酸锌在蛋鸡生产中的研究进展目前国内外对蛋氨酸锌在蛋鸡日粮中的添加量报道不一。许甲平等报道海兰褐蛋鸡饲粮中添加40mg/kg蛋氨酸锌生产性能最佳，可使产蛋率提高4.37%；张亚男等研究发现，产蛋后期海兰灰蛋鸡饲粮中使用硫酸锌且添加水平为70mg/kg时生产效果效果最佳，140mg/kg蛋氨酸锌组蛋壳质量最好。但也有报道称，高剂量的蛋氨酸锌不仅会导致资源浪费和环境污染，而且会导致动物生长受阻，生产性能下降，免疫力低下、抗氧化能力降低。Mabe等报道，饲粮中添加100mg/kg蛋氨酸锌会导致产蛋率下降。立题依据3蛋氨酸在蛋鸡应用中存在的问题：2013年7月，欧盟（EU)发布No.636/2013号法规，批准蛋氨酸锌作为饲料添加剂使用，并规定在家禽中的最大添加量为200mg/kg。在我国，蛋氨酸锌虽为农业部《饲料添加剂安全使用规范》（1224号公告）中规定允许使用的饲料添加剂，并且在蛋鸡生产中取得了较好的效果，但在实际应用中尚存在以下问题；无行业标准、蛋鸡日粮使用的安全性、有效剂量、使用条件、有效的饲用方式（饮水或饲料)等均有待研究确定，在《饲料添加剂安全使用规范》（1224号公告）中未给出安全限量，所以对蛋氨酸锌在蛋鸡上的应用进行安全性评价是很有意义的。立题依据根据《饲料和饲料添加剂畜禽靶动物耐受性评价指南（试行）》（农办牧【2011】21号）以及蛋氨酸锌对家禽营养的特殊性，设计了蛋氨酸锌在蛋鸡上的耐受性试验。主要内容

研究内容2试验方案3

立题依据1试验创新4进度安排5研究内容对蛋鸡进行6个不同剂量的蛋氨酸锌添加处理，探究不同剂量的蛋氨酸锌处理对蛋鸡临床表现、蛋鸡生产性能、蛋品质、血液学指标的影响及对蛋鸡器官组织的毒性作用；通过分析，确定蛋氨酸锌在蛋鸡玉米-豆粕型日粮中的安全限量值，为蛋氨酸锌在蛋鸡生产中应用提供指导。主要内容

研究内容2

试验方案3

立题依据1试验创新4进度安排5试验方案1材料和方法2试验设计3饲养管理及试验记录4指标及测定方法5统计学分析试验方案饲养试验试验记录、采样及指标测定临床观察生产性能鸡蛋品质血液学指标测定组织学检查技术路线统计分析统计分析试验方案表2蛋氨酸锌对蛋鸡耐受性试验设计试验处理蛋氨酸锌添加量（以锌计）试验组Ⅰ基础日粮+0mg/kgZn-Met试验组Ⅱ基础日粮+70mg/kgZn-Met试验组Ⅲ基础日粮+140mg/kgZn-Met试验组Ⅳ基础日粮+350mg/kgZn-Met试验组Ⅴ基础日粮+700mg/kgZn-Met试验组Ⅵ基础日粮+1400mg/kgZn-Met注:添加蛋氨酸锌后调整每组蛋氨酸水平使其保持一致试验方案1材料和方法1.1试验材料1.1.1蛋氨酸锌络（螯）合物产品市场采购蛋氨酸锌络（螯）合物产品，预混合，随同其他饲料原料一起混合。1.1.2试验动物及安置将采食正常、体重相近的健康开产海兰白蛋鸡540只（19周龄，整齐度90%以上），随机分为6个处理，检验各处理间鸡的体重、产蛋率、平均蛋重等差异不显著，每个处理6个重复，每个重复15只鸡，每3只鸡一个单笼（45cm×30cm×30cm）。本试验分为预试期、正试期两个阶段。预试期1周，正试期8周。预试期饲喂正常的蛋鸡全价料，在一个周内逐渐换为参试日粮。试验方案1.2试验设计1.2.1试验处理与安排本试验采用单因子随机区组设计。根据有效性试验得出的有效剂量，设计：0、有效剂量组、2倍有效剂量组、5倍有效剂量组、10倍有效剂量组、20倍有效剂量组，即0、70mg/kg、140mg/kg、350mg/kg、700mg/kg、1400mg/kg。全期需要制作6种全价配合饲料约4t,共需要蛋氨酸锌络（螯）合物10.5kg。消耗饲粮：540×56×120g/h/d=3628.8kg尽量使每个重复分开，6个处理的各重复均匀分布于鸡舍内。试验方案

试验蛋鸡消耗饲粮预测表处理1处理2处理3处理4处理5处理6小计消耗饲粮/kg604.8604.8604.8604.8604.8604.83628.8消耗蛋氨酸锌/kg00.2490352940.4980705881.2451764712.4903529414.9807058829.463341176消耗锌/kg00.0423360.0846720.211680.423360.846721.608768注:蛋氨酸锌络（螯）合物中含锌量为17%试验方案1.2.2试验日粮试验日粮将在参照NRC（1994）和NY/T33-2004的基础上，并结合海兰白产蛋鸡饲养手册配制，试验拟采用玉米-豆粕日粮，日粮组成及营养成分含量见下表。试验方案试验日粮组成和营养成分？试验方案注：1)预混料为每千克日粮提供：VA12500IU；VD34125IU；VE15IU；VK2mg；硫胺素1mg；核黄素8.5mg；泛酸钙50mg；烟酸32.5mg；吡哆醇8mg；叶酸5mg；VB125mg；胆碱500mg；Mn65mg；I1mg；Fe60mg；Cu8mg；Se0.3mg。2)添加蛋氨酸锌后调整蛋氨酸水平，使其水平保持一致。3)营养水平中除锌为实测值，其他均为计算值。试验方案1.3饲养管理及试验记录——饲养方式：采用半开放式鸡舍3层立体笼养，每排相连的5个鸡笼作为一个重复，每笼3只鸡（共用180个鸡笼），各重复平均分布在上中下三排阶梯式笼养架上。——光照制度：采用自然光照和人工补光方式，光照时间为16小时，并保持恒定，采用早晚补光保证光照时间，光照强度为20lx。试验方案——温湿度：每天14:00记录温度和湿度、天气情况；随气候、季节和阳光而变化，试验期间温度变化范围为20.0±5℃；相对湿度在40%~70%。——通风方式：自然通风和横向负压通风相结合；——其他：饲料为干粉料，自由采食，每天加料2次，匀料4次；乳头式饮水器，自由饮水；专人管理，每日捡蛋两次；每周带鸡消毒和清理鸡粪一次；依本地区商品代蛋鸡常规防疫制度进行免疫。试验方案1.4指标及测定方法1.4.1临床观察试验期内每天观察试验动物临床表现、采食和饮水情况、生长情况，发现打蔫鸡只，及时淘汰；详细观察和记录蛋鸡的不良反应。对试验中出现的不明原因的死亡进行尸检，进行组织学分析，确定病因。1.4.2生产性能以重复为单位，记录每天产蛋数（包括软壳蛋、破壳蛋）、日产蛋总质量、死亡鸡数，每周记录鸡的耗料量一次。最后计算出每周和全期的产蛋率、日采食量、平均蛋重、料蛋比、软壳蛋率等生产性能指标。试验方案日期室温病死只数淘汰只数实存只数采食量/kg产蛋量蛋重/kg不合格蛋（破、软）备注重复1重复2重复3重复4重复5重复6产蛋期日常管理记录表试验方案1.4.3鸡蛋品质以重复为单位，每重复、每周采样5枚，每周共采180枚鸡蛋，当日测定鸡蛋品质相关指标。采用蛋品质测定仪（以色列OPK公司生产）测定蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋白高度、蛋黄颜色、鸡蛋分级、哈氏单位和蛋重等指标。鸡蛋采样试验方案鸡蛋品质测定采样记录表周次12345678小计重复6×66×66×66×66×66×66×66×6288鸡蛋数量1801801801801801801801801440试验方案每个重复鸡蛋品质测定记录表编号测定项目蛋重wt(g)蛋壳厚度thk(mm)蛋壳强度str(kgf)蛋白高度height（mm)蛋黄颜色YCF哈氏单位HU鸡蛋分级RK12345试验设计1.4.4血液学指标检测分别于2、4、6、8周末，以重复为单位随机选择1只产蛋鸡，分别用一支抗凝管、一支促凝管采血2ml、5ml。一份全血立即测定血常规指标，包括白细胞计数（WBC)、红细胞计数（RBC)、血红蛋白（HGB)、红细胞压积（HCT）、血小板计数（PLT)。另一份血样于3000r/min离心10min制备血浆，上清液分装于1.5mlEP管中，置于-20℃冰箱保持备用。试验方案血液学指标检测周次2468小计重复6×66×66×66×6144血清36363636144全血36363636144试验方案测定指标如下：（1）基本生化指标谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总蛋白、白蛋白、肌酐、尿酸、血糖、总胆红素、尿酸氮、碱性磷酸酶等指标。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，在酶标仪上进行测定。（2）抗氧化指标谷胱甘肽过氧化物酶、铜锌超氧化物歧化酶、丙二醛含量和总抗氧化能力的测定。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，测定时严格按照试剂盒说明书操作。（3）免疫学指标IgA、IgG、IgM、溶菌酶水平。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，测定时严格按照试剂盒说明书操作。试验方案基本生化指标测定项目测定方法测定意义1AKP微量酶标法评价含锌酶活2GOT赖氏法评价肝脏功能3GPT赖氏法评价肝脏功能4TPRO考马斯亮蓝法评价血清总蛋白指标5UA比色法评价肾脏功能6CRE除蛋白苦味酸比色法评价肾脏功能7GLU葡萄糖氧化酶-过氧化酶法评价血糖指标8TBILI苯甲酸钠-咖啡因比色法评价肝脏功能9BUN脲酶法评价肾脏功能10ALB溴甲酚绿比色法评价肝脏功能115‘-NT评价含锌酶活试验方案抗氧化指标测定项目测定方法测定意义1GSH-PX比色法评价该酶活性2CuZn-SOD抽提法评价含锌酶活3MDATBA法（硫代巴比妥酸法）评价氧化状态4T-AOC比色法测定血清总抗氧化能力试验方案免疫学指标测定项目测定方法测定意义1IgA抗原抗体特异性结合评价免疫能力2IgM抗原抗体特异性结合评价免疫能力3IgG抗原抗体特异性结合评价免疫能力4溶菌酶比浊法评价免疫能力试验设计（4）血浆含锌量：经浓硝酸在MARS5高压密闭微波消解器（CEM，USA）中湿消化后，在IRISIntrepidⅡ等离子体发射光谱仪（TE，USA）上测定Zn的含量。试验方案1.4.5组织学检测（1）内脏器官指数（2）肠粘膜免疫（3）肝脏含锌酶活（4）组织锌含量测定（5）小肠和胰脏MT含量测定（6）小肠、胰脏MT和ZnT-2mRNA水平（7）组织病理学检查试验方案1.4.5组织学检测分别于饲养期的第8、24周，以重复为单位，每个重复选取1只空腹称重，屠宰，解剖。分别按照如下要求采集、制备、保存样品。(1)内脏器官指数：剖取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾、胸腺，剔除脂肪组织，并用滤纸吸取血渍，然后迅速称重。内脏器官指数=内脏器官鲜重（g)/活体重（kg）。（2）肠道粘膜免疫：测定空肠食糜SIgA含量。收集空肠内容物，将内容物与生理盐水1:1稀释，混匀后5000rpm4℃离心15min,分离上清液，测定SIgA含量。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作。试验方案1.4.5组织学检测（3）肝脏含锌酶活：铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD)、碱性磷酸酶（AKP）、5‘-核苷酸酶（5’-NT)活性测定。测定项目测定方法测定意义1CuZn-SOD抽提法评价含锌酶活2AKP微量酶标法评价含锌酶活35‘-NT评价含锌酶活试验一蛋氨酸锌络（螯）合物对产蛋鸡的有效性试验研究主要操作步骤：准确称取肝脏0.40g,加入生理盐水4ml生理盐水，冰浴匀浆5min后，4℃3000r/min离心15min，取上清液。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作。（4）组织锌含量测定：摘取肝脏、胰脏、肾脏、左侧胫骨、蛋黄于-20℃保存，以备分析组织锌含量。测定方法：经浓硝酸在MARS5高压密闭微波消解器（CEM，USA）中湿消化后，在IRISIntrepidⅡ等离子体发射光谱仪（TE,USA）上测定Zn的含量。试验方案（5）小肠、胰脏MT含量：取部分胰脏、小肠于-196℃液氮保存，以备分析MT、ZnT-2mRNA水平。采用镉血红蛋白亲和力分析法分析小肠、胰脏中MT的含量。主要操作步骤：取大约1g组织样品（小肠、胰脏），加3倍体积的冰10mMTris-HCl缓冲液（pH7.4），匀浆1~2min，4℃4000rpm离心30min，取上清沸水浴5分钟，冰浴速冷，4℃10000rpm离心5min，吸取上清液，置于-80℃冰箱保存备用。（6）小肠、胰脏MT和ZnT-2mRNA水平：采用SYBRGREEN实时荧光定量RT-PCR法（QRT-PCR)测定小肠和胰脏中MT和ZnT-2mRNA水平。试验方案主要操作步骤：用Trizol试剂（购于Invitrogen公司）一步抽提法提取小肠和胰脏细胞中的总RNA。用UltraspecⅢ紫外可见分光光度计测定其OD260、OD280，计算OD260/OD280,比值均在1.8以上。用0.8%的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，检测总RNA的完整性。检测后立即对总RNA进行反转录，-80℃冷冻保存待用。采用2–△Ct值法，计算出MTmRNA、ZnT-2mRNA的相对表达量。按照SuperScriptⅢTMFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR试剂盒（购自Invitrogen公司）使用说明，合成cDNA模板。根据MT、ZnT-2序列和β-actincDNA序列，分别设计合成其扩增引物，如下表所示。试验方案试验方案（7）组织病理学检查试验第8周结束时，每重复选择1只健康蛋鸡，称重，进行组织病理学检查。针对出现中毒症状的剂量组及更高剂量组及尸检异常的动物的主要器官（心、肝、脾、肺、肾、胸腺、胰脏、胃、十二指肠、回肠、直肠、淋巴结、输卵管、卵巢等组织）进行系统的组织病理学检查，并与对照组合有效剂量组进行对比。检查方法采用适宜的染色方式，进行石蜡切片观察定性和定量。试验方案1.5统计分析采用SPSS20.0软件的ANOVA程序进行统计分析，用LSD和Ducan法进行显著性检验。以P<0.05为差异显著性标准，P<0.01为极显著。预期结果通过耐受性试验，探究长期高剂量蛋氨酸锌对蛋鸡生产性能、蛋品质、免疫指标、抗氧化能力、血浆生化指标的影响及对机体器官组织的毒性作用；通过分析，确定蛋氨酸锌在蛋鸡玉米豆粕型日粮中的安全限量值，即开始出现毒性反应处理组的前一组处理组的蛋氨酸锌添加量，以期为蛋氨酸锌在蛋鸡生产中应用提供指导。主要内容

研究内容2

试验方案3

立题依据1

试验创新4进度安排5可行性分析浙江大学饲料所是农业部认定的“肉鸡和蛋鸡饲料有效性评价机构”之一，有资格开展新饲料和新饲料添加剂的评价试验，饲料所试验基地有能力承担新饲料和饲料添加剂评价。浙江大学饲料所拥有仪器设备总价值达5000多万元，拥有先进细胞分子生物学仪器能充分保证项目研究的顺利进行。本试验设计方案是在国内外研究基础上，严格参照农业部《饲料和饲料添加剂畜禽靶动物有效性评价试验指南（试行）》和《饲料和饲料添加剂畜禽靶动物耐受性评价试验指南（试行）》（农办牧[2011]21号）进行设计。创新性分析目前，农业部“1224号公告”中将蛋氨酸锌络（螯）合物列为允许使用的饲料添加剂，但在蛋鸡生产中尚