酶联免疫吸附和微 量凝集-ELISA-20121217

酶联免疫吸附(ELISA)

林英

生物技术学院

2012.12.17

免疫酶联吸收试验（ELISA）是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的新型免疫检测技术。

ELISA原理1971年分别由瑞典学者Engrall

和Perlmann

、荷兰学者VanWeeman

和Schuurs

报道。其基本原理是将已知抗原或抗体吸附在固相载体微孔聚苯乙烯塑料板上，通过抗原抗体特异性结合吸附待测样品中的抗体或抗原后，加酶标抗体和底物后，在相应酶底物的作用下生成有色物质，其颜色深浅与标记物中相应的抗体或抗原的含量呈正比，由此可测定抗原或抗体的含量。ELISA的类型间接法双抗夹心法竞争法捕获包被法ABS-ELISA间接法ELISA测定抗体间接免疫酶联吸收是测定抗体最常用的方法，其原理是将抗原联接到固相载体上，样品中待检抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，对待检抗体进行定性或定量测定

ELISA试剂抗原:家蚕蛹血液酶标抗体:goatantirabbitIgG-HRP阳性标准品:免疫家蚕蛹蛋白兔血清阴性对照:未免疫兔血清包被液:1.50gNa2CO3+2.93gNaHCO3加水至1000ml，pH9.6PBS-tween液(洗涤液)：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KCl0.2g,Tween-200.5mL，加水至1000mLELISA试剂封闭液：1％脱脂奶粉/BSA，1g脱脂奶粉/BSA＋100mlPBS-Tween磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0）：0.2mol/LNa2HPO4·12H2O25.7mL，0.1mol/L柠檬酸24.3mL，蒸馏水50mL底物溶液：100mL磷酸盐-柠檬酸缓冲液＋40mg邻苯二胺+100ul30%H2O2终止液:98%H2SO422.2mL+H2O177.80mL实验方法1.包被抗原:先取家蚕蛹血液蛋白100倍PBS稀释液1uL,分别加入到1-4孔中，再取1uL家蚕蛹血蛋白原液分别加入到5-8孔中，最后用包被液99uL加入到各孔中，4℃放置过夜。2.洗板：将包被液倒出，用洗液洗涤3次，每次2分钟，用纸巾包住酶标板，在桌面拍打，甩干孔内液体。3.封闭：每孔加入350ul封闭液，静置1-2小时。4.洗板：同步骤2。5.加一抗：免疫血清分别按1:100,1:500，1:1000封闭液稀释，稀释液分别加到1\5,2\6,3/7孔,4/8孔加自制的兔血1:100封闭液稀释液，每孔100ul，37℃温育60分钟。实验方法6.洗板：同步骤2。7.加二抗：加入用封闭液1:2000稀释的羊抗兔IgG-HRP，每孔100ul，37℃温育60分钟。8.洗板：同步骤2。9.显色：加入现配的底物溶液，每孔100ul，避光显色5-10分钟。10.终止:每孔加入100ul硫酸终止液。11.检测OD值：将酶标板置入酶标仪，读出在492nm波长的光密度值。结果与分析

在酶联板上，0.2≤OD

≤0.5，为蛹血液蛋白抗体弱阳性；OD≥0.5，为蛹血液蛋白抗体强阳性；OD＜0.2，为抗体强阴性。注意事项1.正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。2.在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

(1)固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。（2)包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。

(3)酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

(4)酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护