质粒DNA的小量制备

基因工程实验模块一、质粒DNA的提取和鉴定二、目的基因的获得和重组载体的构建三、感受态细胞的制备、转化及重组子筛选四、目的基因在E.coli中表达与SDS鉴定一、质粒DNA的提取和鉴定实验一、质粒DNA的小量制备实验二、质粒DNA的电泳鉴定实验三、质粒DNA的酶切质粒(plasmid)的基本概念：1）是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制、并被稳定遗传的核酸分子。2）存在于细菌、真菌、蓝藻、酵母等细胞中。背景知识复习4）绝大多数的天然DNA质粒具有共价、闭合、环状的双链结构(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)，以超螺旋形式存在。3）绝大多数质粒是DNA型的，但酵母的“杀伤质粒”是RNA。5）分子大小：1-300kb。质粒的基本特征：自主复制性不相容性可转移性

携带特殊的遗传标记严紧型质粒松弛型质粒

根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多寡，质粒可分为：

质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统，进行自主复制。自主复制性：

1-3拷贝/cell，复制受细胞核控制，伴随染色体DNA复制而复制。如：pSC101、p15A。1）严紧型质粒(stringentplasmid)：

加入氯霉素（终浓度10-170g/ml）抑制细菌蛋白质合成后，可达3000拷贝/cell。2）松弛型质粒(relaxedplasmid)：如：pMB1、ColE1。10-200拷贝/cell，复制不受细胞核控制，染色体DNA复制停止时，仍可进行复制。质粒DNA的提取方法：氯化铯密度梯度离心法碱裂解法沸水浴法氯化铯密度梯度离心法：

质粒纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；碱裂解法：

质粒纯度低、快速、操作简便；沸水浴法：质粒纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间。

在强碱性溶液中，DNA双链的氢键断裂变性；当溶液恢复中性时，DNA双链复性。原理：碱裂解法是最常用的质粒DNA提取方法。12在变性后双链不分离、复性快。闭合环状的质粒DNA：13强碱性

变性后双链分离、难以复性而形成缠绕结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起，离心时沉淀。染色体线性DNA、有缺口的质粒DNA：14本实验的目的掌握质粒DNA提取的碱裂解方法。15实验试剂1）LB培养基：10g/L胰蛋白胨5g/L酵母提取物10g/LNaCl用5NNaOH调pH至7.0，121℃高压灭菌20min。16用无菌H2O配置100mg/ml，-20℃保存；在LB中的终浓度为100g/ml。2）Amp贮存液：174）STE：10mmol/L

Tris-HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA（pH8.0）0.1mol/L

NaCl3）TE：10mmol/LTris-HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA185）溶液I：50mmol/L

葡萄糖25mmol/L

Tris-HCl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）121℃高压灭菌20min，4℃保存。196）溶液II：0.2mol/L

NaOH1%SDS注意：配0.2mol/L

NaOH时，临用前用10mol/L贮存液现用现稀释。207）溶液III：5mol/LNaAc60ml冰HAc11.5mlH2O28.5mlpH为4.8，4℃保存。218）25:24:1酚:氯仿:异戊醇9）氯仿10）无水乙醇11）70%乙醇2210）RNase：10mmol/L

Tris-HCl（pH7.5）15mmol/L

NaCl10mg/mlRNase11）质粒贮存液：含20g/mlRNase的TE或H2O231）葡萄糖

增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力的作用而降解（震荡）。各种试剂的作用：242）EDTAMg2+、Ca2+螯合剂，抑制DNase活性，防止DNA被降解。253）NaOH-SDS

NaOH是强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。

SDS是离子型表面活性剂，溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白质-SDS”复合物，使蛋白质（包括DNase）变性沉淀。4）NaAc-HAc缓冲液

用来中和NaOH变性液，使DNA复性。

高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。5）乙醇DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。

一般使用2倍体积的无水乙醇。286）RNaseA

降解残留的RNA，以免提取后的DNA中含有小分子RNA。297）TE缓冲液：DNA保存液，由Tris-HCl和EDTA配制。

EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。

Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），利于以后操作。

但苯酚会残留在DNA溶液中（现已少用，多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。8）酚-氯仿-异戊醇

蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。实验步骤3）将细菌沉淀重悬于0.5mlSTE中，12000rpm离心1min，弃上清。1）将菌落接种于2ml含100g/ml的LB中，37℃振摇过夜。2）取1.5ml培养物于1.5mlEppendorf管中，于4℃离心12000rpm1min，弃上清。4）将细菌沉淀重悬于100l4℃预冷的溶液I中，盖紧管口，vortex剧烈振荡，使细菌沉淀完全分散，放置5-15min。5）加200l溶液II，盖紧管口，快速颠倒Eppendorf管5次，使管整个内表面均与溶液II接触（不要振荡），冰上放置5-10min。6）加入150l4℃预冷的溶液III，盖紧管口，温和振荡10sec，冰上放置5min。7）4℃离心15000rpm5min，将上清转移至另一EP管中。8）加入等量酚-氯仿-异戊醇，振荡混匀，于4℃离心15000rpm2min，将上清转移至另一EP管中。9）加入等量氯仿，振荡混匀，于4℃离心15000rpm2min，将上清转移至另一EP管中。10）加入2倍体积无水乙醇，振荡混匀，室温放置5min（或-70℃放置30min），4℃离心15000rpm10min，小心吸去上清，将附于管壁的液滴除尽。11）用4℃预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀1-2遍，按上述方法除尽上清，37℃干燥5-10min。12）用含RNase的TE或H2O溶解DNA，贮存于-20℃。

许多公司都研制出成套的商品化质粒提取试剂盒，原理大都依照碱裂解法，但在纯化步骤上采用柱层析，实验步骤参考相应的Protocol。37微量加样器的使用方法3、将吸头浸入待移取的液体液面下2-3mm处，慢慢松开按钮，液体在大气压的作用下进入吸头内。待吸入要求量的液体后，将加样枪撤离液面，擦去吸头外侧的液体，注意不能接触吸头尖部。1、将加样枪刻度或读数调至所需定量吸取的液体量值，并装上合适的吸头。2、将按钮压至第一停点位置（有明显的阻滞感）并保持，以挤出吸头内空气，形成吸头内负压。385、继续按住按钮，撤出加样枪，将吸头弃于特定的盛污染吸头的器皿中，松开按钮至起始位置，将加样枪竖直悬挂在加样枪架上。4、将加样枪移至待加入液体的容器，让吸头位于容器液面的近上方。轻轻压下按钮至第一停点位置，让液体缓缓流出。待液体将流尽时，继续将按钮下压至第二停点位置，并让吸头尖部轻轻接触液面上方的容器壁，以免产生气泡。402、要保证在整个吸液过程中，吸头尖端要一直处于液面之下，即防止吸空造成吸样不准确。1、加样前，一定要检查吸头是否上紧，以免液体漏出或取液不准。3、吸取液体完成后排出液体之前，一定要擦去吸头四周的液体，特别是在取液量较少时尤其要注意这一点，但要防止接触吸头尖端。注意事项：415、排出液体时，在液体将排尽时，要轻轻让吸头尖端接触容器壁，以免在加样的容器中形成气泡。4、吸取液体和排出液体动作都一定要慢，因为动作过快时，液体因表面张力吸附在吸头壁上，造成移液不准。所取液体的粘度越高，越应该注意这个问题。426、加样完成后，应在弃去使用过的吸头后，方才松开按钮至起始位置，以免吸头内的残留液体回吸到枪头，造成交叉污染。7、注意使用一次性吸头，避免交叉污染。8、如不使用，要把加样枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。。43一、实验目的及要求二、实验设备及要求三、实验内容与步骤四、实验结果与数据处理五、分析与讨论实验报告的内容44提质粒步骤1.室温10000xg1min离心收集菌体2.加入250ulSolutionI/RNaseA充分重悬菌体3.加入250ulSolutionⅡ并轻柔颠倒混匀多次直到液体清亮。2min室温孵育。4.加入350ulSolutionⅢ并颠倒离心管多次使充分混匀，直到有白色絮状沉淀产生。5.室温，≥13000xg，15min离心6.小心吸取上清到HiBind柱中（每次700ul），室温，10000xg，1min离心，直到所有上清都过了柱7.加入