选修三 1.1基因工程第一轮复习1

基因工程复习一一、基因工程的基本内容

基因工程，确切地讲就是重组DNA技术，指在体外将不同来源的DNA进行剪切和重组，形成杂合DNA或称嵌合DNA分子，然后将其导入特定的宿主细胞，得到大量扩增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特性，产生新的基因产物。基因工程，或称遗传工程，兴起于20世纪70年代。人类实现对基因进行自如地操作、转移和改造的理想，是在核酸限制性内切酶、载体质粒、连接酶和其它修饰酶被陆续发现以后。在此基础上，核酸和蛋白质序列测定、基因体外快速突变、DNA的人工合成等，则使得基因工程逐渐成熟和发展。操作环境操作对象操作水平基本过程结果生物体外基因ＤＮＡ分子水平剪切拼接导入表达人类需要的基因产物基因拼接技术或DNA重组技术实质：基因重组基因工程培育抗虫棉的简要过程：苏云金芽孢杆菌(有抗虫特性)普通棉花(无抗虫特性)抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)提取关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取。关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接。关键步骤三：抗虫基因进入棉细胞。

通过观察抗虫棉的培育过程，你认为关键的步骤是什么？关键步骤一的工具：基因的剪刀——限制性内切酶。关键步骤二的工具：基因的针线——DNA连接酶。关键步骤三的工具：基因的运输工具——运载体。

1、作用——限制性核酸内切酶能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并在使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。磷酸二酯键即脱氧核糖、磷酸之间的连接ATGGCATCTTCGAA

大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，例如，EcoRΙ、SmaΙ，也有少数有4、5或8个核苷酸组成。GAATTC

CTTAAG

中轴线CTTAA

G

AATTCG

大肠杆菌的一种限制酶（EcoRⅠ)能识别GAATTC序列，SmaI识别CCCGGG序列:

CCCGGG

GGGCCC

CCCGGG

GGGCCC

黏性末端平末端GAATTCGCTTAAAATTCG限制酶切割ＤＮＡ分子示意图CTTAAG思考

要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？两个切口，四个黏性末端。

2、DNA连接酶——“分子缝合针”作用——把两条DNA末端之间的缝隙“缝合”起来。G

AATTCCTTAA

G

即脱氧核糖、磷酸基之间的连接

GP

AP自己动手吧！

限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是否一样呢？E.coliDNA连接酶：连接黏性末端T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端DNA连接酶连接的部位：磷酸二酯键（在“梯子”的扶手处），不是氢键（在“梯子”的踏板处）。结果：两个相同的黏性末端的连接。

思考（１）用DNA连接酶连接两个相同的黏性末端要连接几个磷酸二酯键？（２）用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？２个４个３、基因的运输工具——运载体作用：具备的条件种类：将外源基因送入受体细胞。能在宿主细胞内复制并稳定地保存具有多个限制酶切点具有某些标记基因质粒、噬菌体和动植物病毒。使用运载体的目的：用它作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去。思考：1、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。2、根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。3、DNA连接酶连接的是什么部位？DNA连接酶是将一段DNA片段3′端的羟基与另一DNA片段5′端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键，而不是连接互补碱基之间的氢键。4、DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。质粒的特点1、质粒是基因工程中最常用的运载体；2、存在于许多细菌及酵母菌等生物中；3、细菌DNA外能自主复制的小型环状DNA分子；4、最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；5、质粒的存在对宿主细胞无影响；6、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。（１）质粒上会存在某些标记基因，标记基因有什么用途？（２）要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制性内切酶和几种DNA连接酶处理？思考感受高考已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指。如果在该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是 (全国理综4)

A．3B．4C．9D．12C二、基因工程的基本操作步骤1、获得目的基因2、形成重组DNA分子3、将重组DNA分子导入受体细胞4、筛选含有目的基因的受体细胞5、目的基因的表达一、获得目的基因从基因文库中寻找聚合酶链式反应（PCR）扩增化学合成法目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列已知基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法2构建载体形成重组DNA分子方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。一原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游调控遗传信息的表达(调控序列)编码蛋白质(编码序列)一原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合，能催化DNA转录为RNA一原核细胞的基因结构与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGC一原核细胞的基因结构与RNA聚合酶结合位点AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCRNA聚合酶AGGUCACGUCG一原核细胞的基因结构与RNA聚合酶结合位点AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCAGGUCACGUCG二真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区下游调控遗传信息的表达(调控序列)外显子(能编码蛋白质)内含子(不能编码蛋白质)将重组DNA分子导入受体细胞导入植物细胞补充归纳导入方法（重组DNA分子导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法导入动物的方法将目的基因导入动物细胞显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）导入微生物将目的基因导入微生物细胞4检测和鉴定Ca2＋处理受体细胞成为感受态细胞，再进行混合。筛选含有目的基因的受体细胞

目的基因的表达检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:功能活性鉴定抗性鉴定分别提取什么进行检测DNA附着在膜上硝化纤维素加探针报告基因（含荧光素分子）变性DNA杂交（如检测SARS病毒等）abcd①检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。②检测是否转录出了mRNA，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。③检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原－抗体杂交，看是否有杂交带。④还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。32．（8分）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。(08江苏)请根据以上图表回答下列问题。（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是耐高温（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。引物对B（3）图1步骤③所用的DNA