第九章 凝胶过滤层析及离子交换层析介质20120328

第九章凝胶过滤及离子交换层析介质

第一部分凝胶过滤层析

第一节概述凝胶过滤层析（gelfiltrationchromatography,GF或GFC）是20世纪50年代前后发展起来的一种按分子大小进行分离的纯化手段。在众多分离计划中被广泛采用，不同的文献中采用了多种不同的称谓:凝胶层析（gelchromatography）排阻层析（exclusionchromatography）分子筛层析（molecularsievingchromatography）立体排阻层析（stericexclusionchromatography）体积排阻层析（sizeexclusionchromatography,SEC）凝胶过滤层析

第一节概述凝胶过滤具有的优势:（1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温和，回收率高，重现性好；（2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能在不同pH、温度下进行；

（3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、核酸等大分子物质的纯化；（4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时层析介质不需再生即可反复使用。

凝胶过滤层析

第二节原理一、凝胶过滤的概念不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同,凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.

凝胶过滤层析

第二节原理凝胶色谱分离原理凝胶过滤层析

第二节原理凝胶过滤分离蛋白质的过程（1）蛋白质混合物上柱；（2）开始洗脱，小分子蛋白质进入凝胶颗粒内，大分子蛋白质被排阻在颗粒外；（3）小分子蛋白质被滞留而移动慢，大分子蛋白质移动快，大小不同的蛋白质分子开始分开；（4）大小不同的蛋白质分子完全分开；（5）大分子蛋白质已被洗脱，而小分子蛋白质仍在层析柱内。凝胶过滤层析

第二节原理二、生物分子的相对分子质量、分子大小和形状每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范围是凝胶介质的重要参数。根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类：1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；凝胶过滤层析

第二节原理2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也最长，最后从层析柱中被洗脱；3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质的有效分离对象。如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。凝胶过滤层析

第二节原理在生物大分子的分离中，决定该分子在层析时的保留时间长短即洗脱快慢的因素不仅仅是相对分子质量，分子形状的影响也很大。有着相同分子量，但是形状不同的分子，其保留时间不同。一般来说，分子量相同情况下，不对称程度增加会使分子更容易被阻挡在凝胶颗粒的网孔之外，导致保留时间变短。

凝胶过滤层析

第二节原理三、凝胶过滤的有关理论问题㈠凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的颗粒。凝胶柱的体积参数包括：总柱床体积（totalvolume,Vt），是凝胶经溶胀、装柱、沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积；外水体积（outervolume,V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液相体积的总和；内水体积（innervolume,Vi），是存在于溶胀后的凝胶颗粒网孔中的液相体积的总和；凝胶体积（gelvolume,Vg），又称支持物基质体积（matrixvolumeofthesupport,Vs）或干胶体积，是凝胶颗粒固相所占据的体积，凝胶过滤层析

第二节原理根据凝胶床的组成，总柱床体积等于外水体积、内水体积与凝胶体积之和：Vt=V0+Vi+Vg

凝胶柱体积参数示意图凝胶过滤层析

第二节原理㈡洗脱体积和分配系数洗脱体积Ve定义为自样品加至层析柱上部开始，至洗脱组分达到最大浓度（对映洗脱峰峰顶）时流经层析柱的洗脱液的体积.

凝胶过滤层析

第二节原理凝胶过滤洗脱曲线示意图（组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子）凝胶过滤层析

第二节原理所示层析图谱中，样品由三种组分组成。组分A为全排阻分子，分子量大于凝胶分级范围上限，不能进入凝胶网孔，经凝胶颗粒间隙被洗脱，该组分的洗脱体积Ve等于外水体积V0（Ve=V0）。组分C为全渗透分子，分子量小于凝胶分级范围下限，完全渗透进入凝胶网孔内，在正常洗脱条件下，与凝胶间不存在吸附作用时，此类组分的洗脱体积是最大的，等于外水体积V0与内水体积Vi之和（Ve=V0+Vi）。组分B为部分渗透分子，分子量处于凝胶分级范围内，是此类凝胶能有效分离的物质。根据组分B的分子量，该组分能以一定程度进入凝胶网孔之中，其洗脱体积Ve处于组分A与组分C之间（V0<Ve<V0+Vi）。凝胶过滤层析

第二节原理凝胶过滤层析是一种分配过程，凝胶颗粒内部吸附的溶剂为固定相，流经层析柱的洗脱剂为流动相，样品的洗脱过程就是溶质分子在两相中不断分配平衡的过程，而某种物质的洗脱体积Ve的大小取决于该物质在流动相和固定相之间的分配系数Kd，其关系式为：Ve=V0+Kd·Vi

Kd的值与被分离物质的分子量和分子形状、凝胶颗粒间隙和网孔大小有关，与层析柱的长短、粗细无关。凝胶过滤层析

第二节原理对所有全排阻分子，由于Ve相同，凝胶过滤层析时两两之间无法实现分离，对所有全渗透分子同样如此。如两种物质都是部分渗透分子但分子大小不同，其Kd值不同因而Ve也不同，可实现分离，这种部分渗透分子之间的分离称为分级分离。而不同类别分子之间，即在上图中组分A与组分B，或组分A与组分C，或组分B与组分C之间的分离称为组别分离。凝胶过滤层析

第二节原理当凝胶与被分离组分存在相互作用的情况下会出现Kd>1的情况。这种相互作用包括：（1）疏水作用（2）亲和作用（3）离子间的静电作用

凝胶过滤层析

第二节原理㈢凝胶过滤的分辨率层析分离常采用分辨率（RS）来描述两种物质之间分离效果的好坏。分辨率定义为两个洗脱峰峰顶对映的洗脱体积之差比上两峰在基线上峰宽的和的平均值。式中，Ve1和Ve2——洗脱峰1和峰2的洗脱体积；Wb1和Wb2——洗脱峰1和峰2的峰宽。RS是相邻两个洗脱峰相对分离程度的衡量标准。凝胶过滤层析

第二节原理分辨率Rs的定义凝胶过滤层析

第二节原理分离两种物质时分辨率取决于这两种组分的洗脱体积和峰宽。而决定组分洗脱体积和峰宽的因素包括两种组分的分子大小，凝胶柱的选择性和柱效。选择性是一个系统分离大小不同组分的能力，习惯用相对保留值来表示，定义为：=（Ve2－V0）/（Ve1－V0）Ve1和Ve2——组分1和组分2的洗脱体积；V0——层析柱的外水体积。凝胶过滤层析

第二节原理柱效用在特定实验条件下层析柱的理论塔板数N来表示通常表示为每米层析床所包含的理论塔板数，其计算公式：

Ve——组分的洗脱体积；Wh——洗脱峰半峰高（h1/2）时对映的峰宽。柱效还可用一个理论塔板的高度H来表示：H＝L/N式中L为柱长。凝胶过滤时柱效的好坏取决于层析柱的填充效果，凝胶颗粒的尺寸，柱长，流速等因素，良好的装柱操作，较细的介质，较长的层析柱都有利于提高柱效。凝胶过滤介质的种类

⑴多糖类骨架的介质：多糖类主要为纤维素，葡聚糖及琼脂糖。这类介质具有亲水性及与生物大分子的相容性，可允许生物大分子透过而不发生变性。具有软基质，压力降大，不易操作。四、凝胶过滤介质的种类(2)合成大分子骨架的介质吸取多糖类骨架亲水性的优点，克服其易受微生物侵袭的缺点，开展了合成有机小分子骨架的研究。选用高亲水性单体，经共聚反应并控制孔结构出现了一些合成骨架的介质。（3）由天然大分子与合成高聚物构成混合骨架的介质：这种骨架既可增加介质的刚性及抗微生物侵蚀性，又使介质具有与生物大分子的相容性。凝胶过滤常作为下游的最终精细纯化步骤，例如：肽，多糖，酶，重组蛋白，单抗及大蛋白。针对：样品已纯化部分。凝胶过滤操作，通常上样量的体积越小，分辨率越高。凝胶过滤注意事项最终精细纯化步骤：例如肽与酶蛋白。装柱过程——不要分层。避免凝胶吸附生物大分子。选择分离范围与分子量接近的介质。处理量大的样品，选择粒径较大，流水速度快的介质。处理量小，需要精细分离的样品，选择粒径小且分辨率较高的介质。四、凝胶过滤介质的主要品种（一）葡聚糖系：葡聚糖凝胶是一种微网孔凝胶，在凝胶层析中使用最广泛的一种层析介质。商品名称Sephadex.⑴结构：Sephadex

是以氯代环丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶，交联度影响凝胶的孔结构，依据孔径不同G型凝胶产品。G后面的数字为孔径越大，排阻极限越大。G-10<700,G-25<1000-1500,G-200<5000-80000⑵性能：①溶胀性Sephadex系以干态供应，使用之前需要溶胀（沸水浴加速溶胀）工作范围：工作范围（Mr)=(G-数目）X吸水量X10200X20X10=40000Sephadex是以氯代环氧丙烷交联的葡聚糖珠状凝胶。G后数子越大表示孔径越大，排阻极限越大。②化学稳定性：Sephadex不溶于一切溶剂，在水，盐溶液，碱和弱酸溶液中均为较稳定。因糖苷键在强酸中可发生降解作用所以只能接触强酸的稀溶液。在0.1mol/L盐酸中1-2h,在0.02mol/L盐酸中经6个月无明显变化，要避免使用氧化剂。③物理稳定性：pH中性湿态珠体可经受120℃，30min高压灭菌而不影响色谱性能。④机械强度：Sephadex凝胶的机械强度，取决于交联度。高交联度的凝胶为G15。G15为刚性，G25及G50也能承受一定的压力。⑶主要用途：孔径较小的凝胶（如G10，G15，G25，G50）主要用于脱盐，肽与其他小分子的分离，孔径较大的凝胶用于蛋白质与其它大分子的分离。

DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸分离。⑷衍生系①SephadexLH系：在葡聚糖结构中引入羟丙基就成为LH系列产品，以G-25为母体的衍生物为LH20，以G50为母体则为LH60，经改性后LH系介质具有更广泛的用途，适用于脂类，甾类，脂肪类，激素，维生素及其它小分子的分级分离。

这类介质除水溶液外，还适用用于极性有机溶剂及水有机溶剂的混合物中。②LH系列的主要用途用于有机溶剂中的凝胶过滤。广泛用于吸附色谱及分配色谱：适合于其他凝胶难以处理的样品。排阻极限与原母体凝胶相同。LH20对芳香多环化合物的吸附能力大于LH60，而LH60因为有较大的固定相体积而更适合于分配色谱。⑶SephasorbHPultrafine

该产品也是羟丙基化衍生物，交联度极高，粒径分布窄（10-23um),由于它的刚性及狭窄的粒径范围，使其即可用于中压液相色谱，也可以用于HPLC；由于它的选择性及惰性，使其广泛用于（如醛，酮，酚和核苷酸等）分离，又因为中等极性，所以可以用于正相色谱，也可以用于反相色谱。

HPLC----多肽及小分子中压液相色谱----蛋白质。

（二）琼脂糖系琼脂糖系凝胶都是经过纯化的琼脂糖制备的，其中仅含有极少量的带电荷基团。利用琼脂糖热溶液冷却时可凝胶化的特点，可较为方便地制成珠状物。在凝胶过程中先由单独的多糖链形成双螺旋，然后聚集成胶束。⑴Bio-GelA系：该产品由美国Bio-Rad公司生产的产品，为非交联琼脂糖凝胶（使用温度限制），受热时，凝胶解体，使用温度范围2-30℃,适用pH范围4-13。

⑵Sepharose系：①非胶联结构，不能高压灭菌，仅限制2-40℃。根据琼脂糖含量不同有3种型号，含量为2%,4%,6%的分别为2B，4B6B。

②SepharoseCL是琼脂糖珠体与2，3-二溴丙醇反应后具有共价交联键的产物。交联结构大大提高了珠体的热稳定性及物理化学稳定性，对孔结构无明显影响。交联后的凝胶在还原条件下，经碱水解后以去除硫酸根，减少常带基团。因此，这类介质的非特异性吸附比其母体更小。这种凝胶在中性条件下可以经120℃消毒，其色谱、性能不变，可以用离子交换及亲和吸附剂的母体。

③Superose:由珠状琼脂糖两次交联而制备的新型凝胶为Superose.琼脂糖先与含有双环多氧基及多环氧基的混合长链交联剂进行第一阶段交联。然后，再与含有双功能基的短链交联剂进行第二次交联得到产品。经两次交联后大大提高了介质的刚性，并进一步增加了其物理化学的稳定性。用0.01mol/LHCl及0.1mol./LNaOH在40℃处理两周，色谱性能无明显变化，还可经受70%甲酸处理。

Superose是适用于高流速的高效的高效凝胶过滤介质，有Superose6及Superose12型号，其中含有琼脂糖分别为6%和12%。⑶聚丙烯酰胺系：Bio-GelP是丙烯酰胺与N，N-亚甲基双丙烯酰胺共聚而成的亲水性凝胶，其中含有极少的游离电荷，羧基含量<3.0umol/g

干胶，因此，非特异吸附性很小。这类合成高聚物结构稳定，不受微生物侵蚀，120℃消毒，30min不变性。改变交联剂用量可控制不同孔径，得到不同的排阻极限的系列产品。⑷Superdex系列产品：Superdex

是最新的凝胶过滤介质，是将葡聚糖以共价结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上，形成的复合凝胶。琼脂糖的高交联骨架为保持提供了较高的物理化学稳定性，葡聚糖为介质提供了良好的稳定性。

特点：凝胶为刚性珠体，适合于高流速且分辩率较高，制备级分离效率可达到15000-3000塔板/米。粒径24-44um的为制备级，均适用于HPLC系统。

极低的非特异性及极高的蛋白质回收率。SuperdexPeptide优良的化学稳定性pH适应范围为1-14可在极性有机溶剂如70%乙腈水溶液中进行分离。在70%甲酸溶液中分离疏水性的多肽，同样也可以用于碱性溶液。⑸Toyopearl聚乙烯醇系：以交联聚乙烯醇为骨架的凝胶过滤介质。

Toyopearl为多孔的三向网状结构，大分子链上含有丰富的羟基，骨架为高亲水性，还可以进行化学改造，而得到含有多种功能的离子交换剂及亲和吸附剂的载体。该系统凝胶与生物大分子有相溶性，作为固定化生物催化剂已获得广泛应用。

Toyopearl系的主要性能：①具有优良的物理化学稳定性，不溶于水及有机溶剂，不受微生物的侵蚀。

②由于该系列为合成高聚物，纯度较高，大分子链中几乎无带基团，其非特异性吸附可忽略不计，蛋白质回收高。③该系为半刚性凝胶，适合于高流速，高生产效率的工业规模应用，有较长的使用寿命，120℃反复消毒，色谱性能不受影响。

⑹Ultrogel系

UltrogelA是琼脂糖凝胶，琼脂糖含量为2%，4%，6%分别命名为A2，A4，A6。

Ultrogel

AcA是聚丙烯酰胺与琼脂糖混合骨架的凝胶，它具有较窄的粒径分布及孔径分布，为刚性珠状，具有优良的化学物理稳定性。⑺Bio-BeadS-X系(疏水性凝胶)

Bio-BeadS-X系列是美国BioRad公司的产品，为多孔苯乙烯-二乙烯苯共聚物。其适用于疏水性物质及非水溶液。以二乙烯苯含量控制孔径，但也受到洗脱剂的影响，在芳香族溶剂中其溶胀度大，排阻极限也增大，在醇类中，骨架不溶胀，孔径小，排阻极限也小。多孔玻璃珠其他载体凝胶过滤层析

第三节实验方案设计一、凝胶过滤介质的选择㈠分离目标和凝胶过滤介质的特性根据分离样品的数量和目的，生化分离过程分为分析型和制备型分离。分析型分离中样品的量较少，分离目的包括目标分子纯度测定，分子量测定，分子量分布分析，获取微量的目标分子等。制备型分离涉及样品的量相对较多，分离目的包括对样品进行脱盐和缓冲液交换，去除混合物中的某些杂质，实验室小规模的获取目标物质，以及工业化制备某种物质等。

凝胶过滤层析

第三节实验方案设计凝胶颗粒大小有粗、中、细、超细等，其颗粒直径依次减小。一般情况下，粗规格的凝胶适合于对数量较多的样品进行分离，中规格的凝胶适合于少量、微量样品的制备，常规分析和测定，而细和超细规格的凝胶则适合于微量和极微量样品的分析。凝胶过滤层析

第三节实验方案设计为了成功地分离样品，必须根据样品特性和分离目的合理地设计出分离纯化实验方案。在设计实验方案时，应当考虑的因素主要包括凝胶过滤介质或预装柱的选择，洗脱剂的选择，层析柱尺寸的控制，以及层析过程中有关参数的确定。凝胶过滤层析

第三节实验方案设计㈡选择性曲线和分离范围待分离物质的分子大小是决定选用何种介质的最重要因素，绝大多数情况下，所选凝胶的分级范围应当涵盖目标分子的大小。只有在这种情况下，介质才能对目标分子和其他大小不同的杂质分子表现出不同的选择性（α），从而进行有效分离。凝胶过滤层析

第三节实验方案设计而凝胶的选择性是由基质的性质和结构所决定的，与流动相无关，即凝胶过滤分离效果的好坏主要取决于介质，因此介质的选择十分关键。凝胶介质的选择性曲线对于指导凝胶的选择很有帮助。选择性曲线是凝胶的重要参考指标，一般是通过溶质的有效分配系数Kav对溶质的分子大小作图得到。有时也可以用溶质的洗脱体积Ve对分子大小作图.

凝胶过滤层析

第三节实验方案设计㈢样品和洗脱剂的特性在分子量相同的情况下，分子形状不同的物质分配系数和洗脱体积相差很大。每种介质的选择性曲线都有针对球状蛋白和针对葡聚糖两种，应根据目标分子的形状更接近球状蛋白还是线形的葡聚糖来确定其适合哪种选择性曲线，进而决定介质类型。

在目标分子的分子量或分子形状未知的情况下，一般可以先选择分级范围较宽，有着较高排阻限的介质来进行分离.凝胶过滤层析

第三节实验方案设计二、洗脱剂的选择

凝胶过滤层析中所用流动相即洗脱剂通常不对选择性产生影响，从理论上讲，如果所分离物质不带电荷，可以直接用蒸馏水进行洗脱，实际操作时，当对较大体积的样品进行脱盐实验时，也的确有用蒸馏水洗脱的例子。然而绝大多数情况下人们考虑用缓冲液而不是蒸馏水来作为洗脱剂。凝胶过滤层析

第三节实验方案设计选择缓冲液时首先要考虑的是在纯化过程中维持合适的pH，在此pH下目标分子稳定性良好。大多数凝胶过滤在中性pH附近进行，此时建议使用缓冲能力在pH6~8的水相缓冲系统，此环境对多数生物分子及介质都是适宜的。有的凝胶介质本身会带有少量的负电荷，这会对按分子大小分离的凝胶过滤层析结果产生影响，为了排除这种影响，洗脱剂通常需要具有一定的离子强度，通常0.15mol/L的离子强度足以排除溶质与介质之间任何的离子作用。

凝胶过滤层析

第三节实验方案设计三、层析柱的选择层析柱应当具有以下特点：（1）柱壁材料结实、化学惰性，能够承受一定的操作压力，在常规的层析条件下保持稳定，不与样品及洗脱剂发生相互作用；（2）层析柱的入口和出口部分的死体积尽可能小，低于柱体积的0.1%，这样可以使样品的稀释程度最小化，同时防止已经分离的样品区带在柱下端重新混合；

凝胶过滤层析

第三节实验方案设计（3）柱内有设计合理的凝胶床支持物，既能有效的支撑凝胶床，又不易被堵塞，保证液流能够均匀的通过；（4）容易拆卸，方便清洗，最好配件具有通用性。实验室常用的凝胶过滤柱的内径大多在4~16mm，而柱长大多在25~100cm。

凝胶过滤层析

第三节实验方案设计四、选择预装柱对于高分辨率凝胶介质，其粒度往往较细，要获得好的柱效填充技术非常重要。为了确保此类介质的高分辨特性，很多公司将自己的部分层析介质制成预装柱后出售，由于采用了优良的材料，合理的层析柱结构设计和良好的装柱技术，这些层析柱在耐用性、清洗效果、柱效等很多方面要优于自装柱。当然，其价格相对来说比零售介质更贵。

凝胶过滤层析

第三节层析技术

当实验方案设计完成后，就需要着手对选择好的凝胶介质、层析柱、洗脱剂、样品等进行准备，装柱，平衡，加样，洗脱，样品检测并收集，层析柱的清洗和再生，这些方面统称为层析技术。凝胶过滤层析

第三节层析技术一、凝胶的准备如果介质是以已溶胀好的形式出售的，此类介质一般也无需预处理，使用前静置使介质沉降，倾去上清液，按湿胶∶洗脱剂（v/v）=3∶1的比例添加洗脱剂，搅匀后即可装柱。

如果介质是以固态干胶形式出售的，在使用前需要进行溶胀。溶胀是介质颗粒吸水膨胀的过程，膨胀度（得水值）与基质种类、交联度及洗脱剂种类等有关。为了填充一根选定的层析柱需要称取多少量的干胶是可以计算的：干胶用量（g）＝πr2h/膨胀度（床体积ml/g干胶）

凝胶过滤层析

第三节层析技术二、装柱㈠填充过程装柱质量的好坏直接影响到分离效果，填充得不好的层析柱会导致柱床内液体流动不均匀，造成区带扩散，大大影响分辨率，也会对层析流速产生影响。

装柱过程应避免在通风和日光直晒的环境中进行，以防温度改变造成层析柱内产生气泡。层析柱应在支架上垂直放置。装柱之前先用洗脱剂将层析柱底部死空间内的空气排空.

凝胶过滤层析

第三节层析技术将已处理好的介质放置在烧杯中，倒掉过多的液体，大致使得沉降介质：上清液（v/v）=3∶1。介质太稠在装柱时容易有气泡产生，而介质太稀则很容易在柱中形成多个界面，造成很差的填充效果。将介质悬液轻微搅拌混匀，利用玻棒引流尽可能一次性将介质倾入层析柱，注意液体应沿着柱内壁流下，防止有气泡产生.凝胶过滤层析

第三节层析技术㈡填充质量的评估装柱完成后，在进行层析之前应当对装柱情况进行检查，简单的方法是将柱子对着亮光，利用透过光检查柱床是否规整，是否有气泡或界面存在。

也可以通过对有色物质进行层析并观察区带情况来实现，观察有色区带通过凝胶床时的变化情况可以检验填充效果，填充良好的凝胶柱在洗脱时区带保持均匀、平稳的向下移动。

凝胶过滤层析

第三节层析技术㈢柱的平衡

平衡的目的是为了确保层析柱中凝胶颗粒网孔和间隙中的液体与洗脱剂在组成、pH和离子强度等方面达到完全一致，这样在加样和洗脱过程中就能使待分离组分始终在所需的溶液环境中，有利于目标分子活性的保持和层析行为的稳定性。人们通常采用2~3个床体积的洗脱剂通过层析柱来确保其完全达到平衡。

凝胶过滤层析

第三节层析技术三、样品和洗脱剂的准备洗脱剂配制时采用的试剂应当是分析纯，而所用的水应当为纯水。洗脱剂配制完毕在使用前，最好对其进行过滤。层析前样品如果是固体，可以将其溶于一定体积的洗脱剂中，如果是液体样品，则可以直接加样。为了延长介质的使用寿命和保持高的分辨率，样品中同样必须无颗粒状物质存在。凝胶过滤层析

第三节层析技术样品的黏度是影响上样量和分离效果的一个重要方面.如果样品黏度过高是由于浓度造成的，用洗脱剂或水稀释样品可以达到降低黏度的目的；如果黏度是样品中核酸等杂质引起的，可通过添加大分子聚阳离子化合物如聚乙酰亚胺或鱼精蛋白硫酸盐将其沉淀，或添加核酸内切酶来降低黏度，但这些物质无疑会成为额外的杂质。如果样品黏度非常高的话，也可以通过往洗脱剂中添加蔗糖或葡聚糖增加洗脱剂的黏度来补偿。凝胶过滤层析

第三节层析技术四、加样

当层析柱准备好且平衡完成，样品和洗脱剂准备完毕后,就可以开始加样和洗脱了。加样过程是将一定体积的样品添加至层析柱顶端，并使其进入凝胶柱。凝胶过滤层析

第三节层析技术㈠加样量的选择在进行层析时样品的添加量主要受分辨率的限制，因为分辨率Rs与样品体积/柱体积之比有关，样品体积/柱体积的比值增大会导致分辨率下降。对于分析型分离和难度比较大的分级分离，样品体积/柱体积之比必须很小，此时加样体积应为床体积的0.5-5%,更小的加样比例并不能进一步改善分辨率。对于具体实验的加样量，需根据样品组成和性质，凝胶介质及想得到的分离程度来确定。

凝胶过滤层析

第三节层析技术㈡加样方法和注意事项加样是将一定体积的样品溶液添加至柱床的床面，依靠重力或泵提供的压力使样品进入床面的过程。在加样过程中样品溶液应尽可能均匀添加至床面，这样在柱床的横截面上样品能够均匀进入，另外要防止液流破坏床面的平整性，否则会造成区带形状变差，洗脱峰变宽，从而对分辨率产生很大影响。凝胶过滤层析

第三节层析技术加样的方法有多种，如果采用的是成套液相层析系统，一般都提供标准的加样方法，如通过进样器或注射器等，最终利用泵将样品溶液加入柱床。对于不带有可调接头的传统填充柱，常见的加样方法有排干法和液面下加样法。凝胶过滤层析

第三节层析技术排干法是加样前先将层析柱上口拧开，让床面之上的液体靠重力作用自然排干，当床面刚好暴露时将层析柱下端阀门关闭。阀门的关闭时机必须选择恰当，过早关闭床面上仍留有少量液体会对样品产生稀释作用，关闭过晚会导致床面变干。用吸管将样品轻轻铺加到床面上，注意不能破坏床面的平整，以免造成区带的扭曲和倾斜，然后打开柱下端阀门，受重力作用样品溶液进入床面，当样品刚好完全进入时关闭阀门。最后用洗脱剂充满层析柱内床面上端空间，拧紧层析柱上口，即可以用恒流泵泵入洗脱剂开始洗脱。

凝胶过滤层析

第三节层析技术五、洗脱技术当加样完毕并且样品进入层析柱后，应当立即用洗脱剂对样品进行洗脱，以防样品在层析柱中扩散。通常洗脱过程以一个恒定的流速使洗脱剂通过层析柱，而这个恒定流速由静水压或者泵来控制。凝胶过滤层析时可采用的最大流速受到多种因素的限制，其中最为关键的因素是介质的强度，流速不能超出该介质的最大流速限制.凝胶过滤层析

第三节层析技术采用较大流速的情况出现在组别分离和大规模制备型分离时，前者由于很容易达到所需分辨率，采用高流速可有效缩短分离时间，后者对分离速度、生产效率有着比较高的要求，而对分辨率的要求相对较低，因此这两种情况可在不超过介质最大流速和背景压的情况下尽量采用高流速。在分析型分离时对分辨率的要求较高，因此通常会采用相对较低的流速。

凝胶过滤层析

第三节层析技术六、样品的检测、收集和处理样品进行层析时，各组分的分离情况，目标分子的洗脱情况等都反映在层析图谱中，在层析图谱中，横坐标是时间或洗脱液体积，纵坐标是检测器的读数。

根据样品中组分性质的不同，有多种不同的检测器可供选择。最常用的是紫外（UV）检测器，可以在两到三个固定的波长如280nm，254nm，214nm下测定洗脱液的吸光度.

凝胶过滤层析

第三节层析技术一般来说人们需要获得分离后的样品，因此需要收集通过层析柱的洗脱液。对于最简单的样品分离，可以采用手工收集的方法，观察到层析图谱中出现洗脱峰时开始收集，到洗脱峰结束时终止收集。液相层析系统一般都配置了分部收集器来对样品进行收集。收集的模式可以有多种，常用的是按规定的时间或洗脱液体积进行分部收集，也可根据检测器检测到的洗脱情况，按洗脱峰进行收集。凝胶过滤层析

第三节层析技术七、凝胶过滤介质的再生、清洗和贮存

理论上来说，在洗脱剂具有一定离子强度的情况下，样品中所有组分都应当在一个柱体积内被洗脱，当洗脱液体积超过一个柱体积时洗脱即可停止.但实验中通常会使用1.5~2个柱体积的洗脱剂来完成洗脱过程。在清洗方法上，最为常规的是采用碱洗，根据介质的pH稳定范围（短程）不同，用0.1~0.5mol/L的NaOH溶液对介质进行清洗除去污染物。

凝胶过滤层析

第三节层析技术浸泡在溶液中的层析柱和介质在很少使用的情况下容易出现微生物生长的现象，尤其是葡聚糖和琼脂糖类型的凝胶介质，易于感染会分泌糖苷酶的微生物，导致基质聚合物中的糖苷键降解而破坏了介质的结构。因此，无论是层析柱还是介质，在长期不使用时，不建议浸泡在对于微生物生长来说营养丰富的缓冲液如磷酸盐缓冲液中，另外，在其浸泡的溶液中添加适当的抑菌剂是必须的。凝胶过滤层析

第四节应用实例

凝胶过滤层析可以应用于多种情况，例如对样品进行脱盐和缓冲液交换，测定目标分子的相对分子量，测定多聚物的分子量分布，测定亲和过程的平衡常数，当然还有对样品进行分析型或制备型的分离，等等。

凝胶过滤层析

第四节应用实例一、脱盐脱盐是指将盐类等小分子物质从样品中除去,从而得到仅剩大分子物质的样品溶液.与透析法相比,凝胶过滤脱盐具有样品处理量大,操作时间短,不影响生物大分子活性等突出的优点。脱盐过程属于组别分离,目标分子和盐类等在分子大小上存在很大的差异,很容易达到所需分辨率,因此对于介质和层析柱的效率要求较低.选择合适粒度的介质，使层析过程的背景压力较低,目标分子在外水体积V0被洗脱,小分子在一个柱体积内被完全洗脱,即能达到脱盐要求。

凝胶过滤层析

第四节应用实例脱盐过程的目的是为了除去样品中的盐类等小分子，当然在此过程中人们不希望引入其他小分子杂质，因此脱盐时可以直接采用蒸馏水作为洗脱剂，以避免引入缓冲盐等组分。脱盐操作既可以在很小的规模上对微量样品进行，也可以在很大规模上进行。

凝胶过滤层析

第四节应用实例

层析柱：85040mm

i.d.，介质SephadexG-25，样品：O，血红蛋白；X，NaCl。加样体积：A＝10ml，B＝400ml。用凝胶过滤对大体积样品脱盐

凝胶过滤层析

第四节应用实例三、相对分子质量的测定凝胶过滤层析是常用的测定生物分子相对分子质量的方法。与其他一些分子量测定方法如电泳技术相比，凝胶过滤法能够在很宽的pH、离子强度、温度范围内测定天然非变性条件下生物分子的分子量，并且测定过程较为简单，不受目标分子带电状态的限制，因而在实验室中被广泛使用。凝胶过滤层析

第四节应用实例依据公式:凝胶过滤法测定分子量的基础是公式Kav=a－blogMr即有效分配系数Kav与溶质分子量的对数logMr之间线性关系，也就是介质的选择性曲线的线性部分。对于特定的凝胶柱，由于外水体积和柱体积是恒定不变的，根据公式可知，Kav=（Ve－V0）/（Vt－V0）在一定分子量范围内，洗脱体积Ve与logMr之间也存在线性关系。由于选择性曲线是呈现S型的，在选择性曲线的两端，并不是理想的线性关系，因此在测定分子量时，目标分子的有效分配系数必须满足0.1<Kav<0.9，这也是所选介质的工作范围。凝胶过滤层析

第四节应用实例具体做法:利用上述线性关系，人们通过将几种已知分子量的物质加样至层析柱，分别测出洗脱体积Ve，同时计算出这些分子相应的logMr值，并以Ve对logMr作图，即得到该层析柱的分子量标准曲线。然后在相同的条件下对需要测定分子量的物质进行层析，测出其Ve值，根据标准曲线即可求出该物质的分子量。凝胶过滤层析

第四节应用实例凝胶过滤层析蛋白质分子量标准曲线

凝胶过滤层析

第四节应用实例五、混合物的分级分离㈢分离多糖多糖与蛋白质、脂类形成的糖蛋白、脂多糖在细胞的识别、分泌以及在蛋白质的加工和转移等方面起着不容忽视的作用。近20年来，人们进一步发现多糖在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血等方面具有重要的生物活性作用，因而糖生物学的研究逐渐成为生命科学领域研究的热点，而在多糖的分离纯化和分子量分布分析中，凝胶过滤层析的应用也被广泛地报道。凝胶过滤层析

第四节应用实例具体实例:从医用真菌Phellinus

linteus的子实体中纯化一种酸性蛋白聚糖的方法。首先通过热水抽提、过滤、有机溶剂沉淀、透析和冻干等一系列过程得到粗多糖，然后用阴离子交换层析和凝胶过滤层析结合使用纯化其中的酸性组分。

凝胶过滤层析

第四节应用实例从Phellinus

linteus的子实体中提取的粗多糖中纯化酸性蛋白聚糖

DEAE-纤维素离子交换层析，横坐标为分部收集时的分部号，纵坐标O.D.值经DNS显色后测出；对离子交换后的活性分部进行SepharoseCL-4B凝胶过滤层析，O.D.值经DNS显色后测出。第二部分离子交换层析

第一节概述离子交换层析（Ion-exchangechromatography，简写IEC）是发展最早的层析技术之一。古代人们使用沙石来净化饮用水就是利用了离子交换的原理;

目前，离子交换层析已成为蛋白质分离纯化中最常用的手段.离子交换层析

第一节概述离子交换层析具有特点：（1）分辨率高，（2）交换容量高，有利于放大分离规模和在工业生产中应用，（3）应用灵活，（4）分离原理比较明确，（5）操作简单易行，离子交换层析

第二节相关理论一、离子交换基本原理

带电的生物大分子和离子交换色谱填料上的离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离。离子交换层析

第二节相关理论离子交换色谱中所进行的离子交换过程（以阳离子交换树脂为例）离子交换层析

第二节相关理论离子交换层析的本质:目的物与离子交换剂的结合能力首先取决于溶液pH，它决定了目的物的带电状态，此外还取决于溶液中离子的种类和离子强度。起始条件，溶液中离子强度较低，上样后，目的物与交换剂之间结合能力更强，能取代离子而吸附到交换剂上；洗脱时，往往通过提高溶液的离子强度，增加了离子的竞争性结合能力，使得样品从交换剂上解吸.离子交换层析

第二节相关理论其它作用力：疏水相互作用和氢键.目的物与离子交换剂发生结合主要依靠相反电荷之间的离子键，但实际上此过程中还可能存在其它的作用力，常见的就是疏水相互作用和氢键。疏水相互作用主要出现在使用带非极性骨架的离子交换剂时，例如聚苯乙烯树脂.

氢键主要出现在使用以亲水性高分子为骨架的离子交换剂，如以Sephadex或Sepharose为基质的离子交换剂.离子交换层析

第二节相关理论离子交换剂由水不溶性基质和共价结合在基质上的带电功能基团组成，带电功能基团上还结合有可移动的与功能基团带相反电荷的反离子（又称平衡离子）。反离子可被带同种电荷的其它离子取代而发生可逆的离子交换.离子交换剂的类型

离子交换剂的分类可以依据其基质成分或功能基团来进行.按功能基团分为强阳、强阴、弱阳、弱阴四种类型.按基质构成分为离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换琼脂糖等。离子交换树脂离子交换树脂的结构带有活性基团的网状高分子聚合物骨架活性基团酚醛树脂聚乙烯树脂交联剂酸性基团碱性基团—SO3H—COOH—N+R3—NR2Ionexchangeresins特殊基团常见的离子交换功能基团类型名称英文符号功能基团阴离子交换剂二乙基氨乙基DEAE－OCH2CH2N+H(C2H5)2季铵基乙基QAE－OCH2CH2N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3季铵基Q－OCH2N+(CH3)3三乙基氨乙基TEAE－OCH2CH2N+(C2H5)3氨乙基AE－OCH2CH2NH3+阳离子交换剂羧甲基CM－OCH2COO－磺丙基SP－OCH2CH2CH2SO3－磺甲基S－OCH2SO3－磷酸基P－OPO3H2Whathappensinionexchange?Equilibration++++++-------anionexchangebead106Whathappensinionexchange?Sampleapplicationandwash-----------++++++----107Whathappensinionexchange?Elution----------------------------------++++++++++++--108Whathappensinionexchange?Regeneration-----------------------++++++109Whathappensinionexchange?SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------110

离子交换层析

第二节相关理论1．上样阶段，此时离子交换剂与平衡离子结合；（平衡阶段）2．吸附阶段，混合样品中的分子与离子交换剂结合；3．开始解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；4．完全解吸阶段，目标分子被洗脱；5．再生阶段，用起始缓冲液重新平衡层析柱，以备下次使用。离子交换层析一般步骤离子交换层析

第二节相关理论无机离子与交换剂的结合能力与离子所带电荷成正比，与该离子形成的水合离子半径成反比。也就是说，离子的价态越高，结合力越强，价态相同时，原子序数越高，结合力越强。在阳离子交换剂上，结合力强弱顺序为：Li+<Na+<K+<Rb+<Cs+Mg2+<Ca2+<Sr2+<Ba2+Na+<Ca2+<Al3+<Ti4+在阴离子交换剂上，结合力强弱顺序为：F-－<Cl－-－<Br－-－<I－-－

离子交换层析

第二节相关理论离子交换的分辨率离子交换的效果常用两个目标峰的分辨率（RS）来描述。分辨率定义为两个洗脱峰峰顶对映的洗脱体积之差比上两峰在基线上峰宽的和的平均值。式中，VR1和VR2——洗脱峰1和峰2的洗脱体积；Wb1和Wb2——洗脱峰1和峰2的峰宽。洗脱体积和峰宽应使用相同的体积单位表示。离子交换层析

第二节相关理论RS是相邻两个洗脱峰相对分离程度的衡量标准.假设两个相邻洗脱峰面积相等，RS＝1.0时，两峰实现主体分离；若达到完全分离，要求RS≥1.5。需指出的是，一个完全分离的洗脱峰在很多时候并不意味着是单一组分，当分离参数改变后，往往又能分开成为若干个峰。不同分辨率下的分离效果

离子交换层析

第二节相关理论一个纯化系统能够达到的分辨率取决于该系统的选择性、效率和容量，这是柱层析中的三个最重要的参数。RS的解析表达式为：㈠容量因子一般来说，容量因子k’的取值与可交换分子在固定相（离子交换剂）和流动相（缓冲液）中的分配性质、层析温度及固定相和流动相的体积比有关，而与柱尺寸和流速无关。

离子交换层析

第二节相关理论㈡柱效率柱效率用在特定实验条件下层析柱的理论塔板数N来表示，通常表示为每米层析床所包含的理论塔板数.柱效率下降会导致层析时区带变宽，也就是洗脱峰的峰宽变大。

离子交换层析

第二节相关理论㈢选择性选择性是一个系统分离不同蛋白峰的能力，习惯用相对保留值α来表示，从对分辨率的影响上来看，好的选择性往往比高的柱效率更为重要.离子交换层析

第三节方案设计和层析技术一、离子交换剂的选择二、缓冲液的选择和层析条件的确定三、层析柱的尺寸四、离子交换剂的准备五、样品的准备六、加样七、洗脱技术离子交换层析

第三节方案设计和层析技术在选择了采用离子交换技术后，要想获得好的分离效果，需要考虑的问题包括：1.分离的规模有多大，采用何种分离模式；2.选用什么样的离子交换剂；3.何种规格的层析柱；4.选用何种缓冲液，起始条件如何确定；5.采用何种方法洗脱等。只有在这些问题都得到解决之后，才能设计出初步的实验方案并付诸实施。离子交换层析

第三节方案设计和层析技术1.分离的规模有多大，采用何种分离模式

关于分离的规模和选用的模式。对于分析型分离和实验室小规模制备型分离，一般采用常规的柱层析技术；而对于大规模工业化分离，可以有柱层析、膨胀床吸附、分批分离等多种模式可供选择。

离子交换层析

第三节方案设计和层析技术2.离子交换剂的选择为了能满足快速分离的要求，所选择的介质应当能够在承受高的流速的前提下有着较低的背景压力。由于样品的数量大，高的有效交换容量是必需的，因此介质应当具有大孔型的结构和较高的取代程度。此外，该介质还必须能够满足原位清洗（CIP）的要求，对于大规模的层析柱，每次分离后将介质倒出清洗和再生，然后重新装柱将是难以想象的。离子交换层析

第三节方案设计和层析技术3.缓冲液的选择和层析条件的确定作为固定相的离子交换剂选择好以后，还需要确定作为流动相的缓冲液，这里包括缓冲物质的种类，起始缓冲液的pH和离子强度，极限缓冲液的pH和离子强度等。离子交换层析

第三节方案设计和层析技术一般的原则是，进行阳离子交换时，选用缓冲离子为阴离子的缓冲物质；进行阴离子交换时，选用缓冲离子为阳离子的缓冲物质。当然这并不是绝对的，但是当选用的缓冲离子与功能基团带相反电荷时，应特别注意在上样前确保层析系统与起始缓冲液之间在pH和离子强度上都达到平衡。在此前提下，选用何种类型的缓冲物质取决于层析时的pH条件，后者又与目的物的等电点有关。确定了起始pH以后，根据缓冲物质的pKa值，选用pKa与起始pH很接近的物质作为缓冲成分。

离子交换层析

第三节方案设计和层析技术以上确定缓冲液的方法是建立在目的物的等电点已知的基础上的，但在更多情况下，人们对目的物的性质未必清楚，此时缓冲液及起始pH的确定可以通过试管小试法确定.

离子交换层析

第三节方案设计和层析技术具体操作如下：（1）准备10支15ml试管；（2）每管加入0.1g基于交联葡聚糖的离子交换剂或1.5ml基于琼脂糖或纤维素的离子交换剂；（3）配制一系列浓度为0.5mol/L的不同pH的缓冲液，相邻两种缓冲液的pH相差0.5个单位，如果使用阴离子交换剂，这个系列的缓冲液pH分布在5～9，如果使用阳离子交换剂，这个系列的缓冲液pH分布在4～8;离子交换层析

第三节方案设计和层析技术（4）各取10ml上述不同pH的缓冲液分别加入10支试管中用以平衡交换剂，混合一段时间后弃去上清液，再分别加入10ml新鲜缓冲液，反复10次后可以使试管内的交换剂在pH上完全与缓冲液达到平衡;（5）再用10ml低浓度的同一pH的缓冲液洗涤各试管中的交换剂，反复5次可确保试管内的交换剂在离子强度方面与起始缓冲液保持一致；（6）各支试管中加入相同数量的样品，混合放置5～

10min；（7）使离子交换剂沉降，分析上清液中目的物含量，结果如图所示。离子交换层析

第三节方案设计和层析技术试管法确定起始pH和离子强度A．确定起始pH为7.0；B．确定起始盐浓度为0.15mol/L，洗脱盐浓度为0.3mol/LAB离子交换层析

第四节方案设计和层析技术确定起始缓冲液的离子强度时，多数情况下人们直接采用由缓冲物质提供离子强度的方法，即不额外往缓冲液中添加非缓冲盐，缓冲物质的浓度（一般为0.02～0.05mol/L）决定了离子强度，只要起始pH选择合适，在此离子强度下目的物完成能够与交换剂结合。另外，多数情况下在完成吸附后，人们通过增加洗脱液离子强度的方式将目标蛋白从层析柱上洗脱下来，洗脱缓冲液就是由起始缓冲液添加特定浓度的非缓冲盐组成，而非缓冲盐所需的浓度同样可以通过试管小试法确定。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术选择缓冲液时除了考虑缓冲物质成分、pH和离子强度外,有时还需要注意其它一些问题。当离子交换后的洗脱组分需要进行冷冻干燥时，应考虑选用挥发性的缓冲物质，以尽可能少的将杂质成分带入最终产品中。如果是大规模工业化分离，缓冲液的用量往往是非常大的，缓冲物质的价格也是必须考虑的问题，应当在pKa值相近的几种缓冲物质中选用最廉价的。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术在有些情况下，离子交换的缓冲液中还会添加一些其它的化合物，其作用主要有：增加目的物的溶解度、提高层析分辨率、保护待分离物质等。离子交换层析

第四节方案设计和层析技术三、层析柱的尺寸离子交换层析通常选用短的层析柱，即高径比小的层析柱,典型的离子交换柱高度在5～20cm，高径比一般小于5。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术四、离子交换剂的准备

选择好离子交换剂后，进行离子交换层析前，必须先将离子交换剂准备好，这包括离子交换剂的预溶胀和清洗、装柱以及用起始缓冲液平衡层析柱直至流出液在pH和离子强度方面与起始缓冲液一致。离子交换层析

第四节方案设计和层析技术㈠离子交换剂的预处理Source系列、MonoBeads系列和MiniBeads系列等细颗粒介质通常产品供应商已经将其制成预装柱出售，使用前不需预处理，直接用起始缓冲液平衡后即可加样。基于琼脂糖的Sepharose系列和Bio-GelA系列离子交换剂，以及DEAE-Sephacel交换剂是以液态湿胶形式出售的，一般也无需预处理，使用前倾去上清液，按湿胶∶缓冲液（v/v）＝3∶1的比例添加起始缓冲液，搅匀后即可装柱。离子交换层析

第四节方案设计和层析技术基于Sephadex的离子交换剂以固态干胶形式出售，使用前需要进行溶胀。溶胀过程通常应将交换剂放置在起始缓冲液中进行，完全溶胀在常温下需1～2天，在沸水浴中需2个小时左右，而且在高温下溶胀还能起到脱气的作用。在溶胀过程中应避免强烈搅拌.基于纤维素的离子交换剂也是以干态形式出售的，使用前需要进行溶胀。也需要先倾泌除去细的颗粒，然后用酸碱轮流洗涤，洗涤时所使用的酸碱浓度大于纤维素交换剂，一般可用2mol/L的NaOH和HCl进行处理。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术㈡装柱装柱是层析技术的一个重要环节，装柱质量的好坏直接关系到分离效果.装柱之前首先用缓冲液将层析柱底部死空间内的空气排空，将预处理好的离子交换剂放置在烧杯中，倾去过多的液体，大致使得交换剂∶上清液（v/v）=3∶1，轻微搅拌混匀，利用玻棒引流尽可能一次性将介质倾入层析柱，注意液体应沿着柱内壁流下，防止有气泡产生.

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术㈢选择预装柱

很多公司将自己的层析介质制成预装柱后出售，由于采用了优良的材料，合理的层析柱结构设计和良好的装柱技术，这些层析柱在耐用性、清洗效果、柱效率等很多方面要优于自装柱。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术㈣柱的平衡平衡过程的目的是为了确保离子交换剂上的功能基团与起始缓冲液中的平衡离子间达到吸附平衡。判断层析柱是否已经达到平衡是通过检验柱下端流出的洗脱液与起始缓冲液在pH、电导和离子强度方面是否达到一致，由于在这几个指标中通常pH最难达到平衡，所以往往检测洗脱液的pH即可。对于一些弱型离子交换剂，由于本身具有一定的缓冲能力，直接用起始缓冲液是很难将其平衡至起始pH的，此类交换剂在装柱前就应当用酸或碱将其pH先调节至起始pH，装柱后再用起始缓冲液进行平衡。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术五、样品的准备

在任何形式的层析中，样品中必须无颗粒状物质存在,因此混浊的样品在上柱前必须通过过滤或离心除去颗粒状物质。离子交换层析

第四节方案设计和层析技术样品的粘度是影响上样量和分离效果的一个重要方面，如果样品粘度过大是由于浓度过大造成的，那么用起始缓冲液稀释样品可以达到降低粘度的目的；如果粘度是由样品中存在的核酸等杂质引起的，可以通过添加大分子聚阳离子化合物如聚乙酰亚胺或鱼精蛋白硫酸盐将其沉淀，或者添加核酸内切酶来降低粘度，但这些物质的添加无疑会引入额外的杂质，在后续分离中必须将其除去。在离子交换层析上样前必须确保样品溶液在pH和离子强度方面与起始缓冲液是一致的，这样才能保证在起始条件下目的物能吸附在离子交换剂上

.离子交换层析

第四节方案设计和层析技术六、加样㈠.加样量的选择理论上，将所使用的离子交换剂的有效交换容量乘上层析柱柱床的体积就可以计算出最大加样量,但事实上有效交换容量并不是常数.因此，在离子交换层析中为了获得理想的分离效果，建议加样时样品中目的物的含量不应超过其有效交换容量的10～20％。

实践中有时目的物的含量是未知的，可以通过试管小试法来确定最大加样量。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术具体的操作:在10支试管中分别加入相同数量的离子交换剂，用起始缓冲液充分洗涤、平衡，然后往10支试管中分别加入数量递增的样品溶液，相邻两支试管间加样量的差值是恒定的，充分混合完成吸附，分析上清液中目的物的含量，上清液中不含目的物而加样最多的试管对应的加样量即为试管条件下的最大加样量，根据试管内以及层析柱床离子交换剂的体积可以计算出层析条件下的最大加样量。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术㈡加样方法和注意事项在加样过程中样品溶液应尽可能均匀的添加至床面，防止液流破坏床面的平整性，否则会造成区带形状变差，洗脱峰变宽。

常见的加样方法有排干法和液面下加样法。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术七、洗脱技术多数情况下，在完成了加样吸附和洗涤过程后，大部分的杂质已经从层析柱中被洗去，然后需要改变洗脱条件，使起始条件下发生吸附的目的物从离子交换剂上解吸而洗脱.离子交换层析

第四节方案设计和层析技术㈠洗脱机制溶质在柱上吸附或交换的量的多少，我们可用吸附平衡常数或称为分布系数α来表示，其定义可用数学式表示为：α＝被吸附的某溶质量/某溶质总量＝固定相/（动相+定相）吸附平衡常数α的取值在0～1之间，不同α值下，溶质的吸附强度不同，被洗脱的难易程度也会出现变化。若α=0，溶质没被吸附，可能不带电或带相同电荷，在一个柱体积被洗脱，在柱中移动速度等于缓冲液的液速，有：Ve==Vt离子交换层析

第四节方案设计和层析技术若α=1或接近1，目的物可被完全吸附或几乎完全吸附，溶质的动速等于0，Ve=→∞若α=0.9，溶质90%被吸附，动速=（1－α）流速=0.1流速,Ve==10Vtα动速/液速=1－αVe

10.9950.990.90.80.60.50.40.1000.0050.010.10.20.40.50.60.91∞2001001052.521.61.11不同吸附平衡系数α下溶质所需的洗脱体积

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术离子交换层析

第四节方案设计和层析技术α的影响因素：⑴pH影响到电性与电量，可使α发生变化；⑵离子强度增大，可使α下降，减弱溶质的吸附；⑶溶质的电荷分布，离子交换剂的电荷分布及位阻效应对溶质的α都有影响；⑷溶质的浓度与α则呈反比关系。离子交换层析

第四节方案设计和层析技术根据上述讨论的洗脱机制，要使蛋白质从离子交换剂上解吸而被洗脱，采取的方法有：⑴改变洗脱剂的pH，⑵增加洗脱剂的离子强度，

⑶往洗脱剂中添加特定离子，⑷往洗脱剂中添加一种置换剂，它能置换离子交换剂上所有蛋白质，蛋白质先于置换剂从柱中流出，这种层析方式称为置换层析。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术㈡阶段洗脱阶段洗脱是用一系列洗脱剂进行的同溶剂洗脱，在每一阶段，仅仅需要约一个柱体积的洗脱剂将此条件下发生解吸的组分洗脱下来。阶段洗脱分为pH阶段洗脱和离子强度阶段洗脱。pH阶段洗脱是用一系列具有不同pH的缓冲液进行洗脱，多数情况下这些缓冲液的缓冲物质是相同的，只是弱酸碱和盐的比例不同。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术离子强度阶段洗脱是使用具有相同pH而离子强度不同的同一种缓冲液进行洗脱，不同的离子强度通常通过添加不同比例的非缓冲盐来实现，最常用的非缓冲盐是NaCl，也可通过添加乙酸铵等挥发性盐的方法来增加离子强度，或直接增加缓冲液中缓冲物质的浓度来增加离子强度.

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术阶段洗脱技术简单易于操作，对于一些层析条件已经清楚的蛋白质往往有着高的分辨率.但阶段洗脱有时效果并不理想.

在初次分离目标蛋白时，人们往往先采用连续梯度洗脱，待确定了样品的特性和洗脱条件后再考虑采用阶段洗脱来优化分离效果，缩短操作时间。离子交换层析

第四节方案设计和层析技术

离子强度线性梯度洗脱和阶段洗脱分离牛血清蛋白图谱离子交换层析

第四节方案设计和层析技术离子强度阶段洗脱和线性梯度洗脱效果对比离子交换层析

第四节方案设计和层析技术㈢梯度洗脱在进行梯度洗脱时，洗脱缓冲液的离子强度或pH是连续发生变化的，在某一条件下，吸附最弱的组分先被洗脱，在进一步改变洗脱条件后另一种组分被洗脱。洗脱峰的峰宽一般会小于阶段洗脱，拖尾现象也会得到明显的改善甚至完全消除，并且不会造成同一组分被分离成几个峰的现象，常常能获得较高的分辨率。梯度洗脱也分为pH梯度洗脱和离子强度梯度洗脱。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术在层析过程中梯度缓冲液可以通过梯度混合器来获得。它们都是根据连通器原理来产生连续变化的梯度。

盐浓度梯度曲线可以有不同的形状，当A1＝A2时，产生的是线性梯度；当A1＜A2时，产生的是凸形梯度；当A1＞A2时，产生的是凹形梯度.离子交换层析

第四节方案设计和层析技术梯度的形状及产生装置

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术1.在选择梯度的形状时，如果是对目的物首次进行离子交换分离，强烈建议采用线性梯度.2.凸形梯度有利于改善梯度末尾部分的分辨率，对于一份混合样品，如果开始阶段几个洗脱峰之间能够很好的分离，而末尾部分的几个组分吸附能力比较接近时，采用凸形梯度既有利于末尾部分组分的分离.3.凹形梯度有利于改善梯度起始阶段的分辨率，如果混合样品起始部分组分吸附能力比较接近而末尾部分容易分开，采用凹形梯度能达到改善分辨率和缩短分离时间的效果。

离子交换层析

第四节方案设计和层析技术除了梯度的形状，梯度的高度和斜率也影响着分离的速度和效果。梯度的斜率是指梯度的高度与完成此梯度时所用洗脱剂体积（或时间）的比值。在洗脱过